【正文】 ifuge 為獲得高純度 Escherichia coli 的 plasmid DNA ，可以使用 Qiagen Spin Miniprep Kit 裝置。 注意 : 所有的記錄步驟應(yīng)該是在室溫實(shí)行 。 立刻加入 350 μ l Buffer N3 然后立即顛倒 46 次混勻。如果是使用 Host 變應(yīng)株如 XL1 Blue、 DH5α ? 作為 宿主菌則這一附加的洗滌步驟可以省略。 將 QIAprep column 加到干凈的 ml microcentrifuge tube 中。 sequencing center 已經(jīng)開始使用新的儀器，因此你可能需要考慮在水中而非 EB中洗脫樣品。我習(xí)慣使用 EB 洗脫，我的反應(yīng)序列結(jié)果是很漂亮的。明確地說，它是一個 339。典型地說， DNA 和 plasmid 載體 ,然后兩者通過連接酶連接。 吸液加樣之前將 buffer 渦旋混勻。 這一儀器用于分析典型的 DNA 連接酶（ kb 質(zhì)粒載體 + kb 插入的重組 DNA 粘性末端），其分析效果是非常好的。 Ligase buffer 可以牢牢吸附游離的 ATP。 ,時其形成塊狀 . 10 ml全懸緩沖液中重懸 .盡可能時病菌保存在冰上 ,使蛋白水解作用降到最低 . 參照 French Press 2x 12,000psi. Add PMSF 溶解細(xì)菌 ,如果有必要 ,在壓制前加入 French Press 2x 12,000psi. Add PMSF 溶菌液 ,在 10K 4C 離心 10分鐘，形成塊狀沉淀 .取 ul 上清液制備SDSPAGE,待其凝集 ,取 ul上清液檢查蛋白質(zhì)是否被充分溶解 . 將菌液轉(zhuǎn)移到 15 ml 離心管中 ,10K 1039。有些人會省略濃縮膠 . 蛋白質(zhì)凝膠的制備方法與核酸聚丙烯酰胺一樣 ,不同的是澆注濃縮膠時要充分利用底部的間隔裝置 ,凝膠要垂直澆注 .將庫存的 30% acrylamide (:1 acrylamide: bisacrylamide)稀釋至濃度為 1X 的 stacking/separating gel buffer ,聚合時 isopropanol 置于凝膠上 ,以提供一表面平滑的分離膠 .凝膠完全凝固聚合后 ,注入 isopropanol,并用純水漂洗凝膠頂部 ,然后使用 Whatman 濾紙小心吸出凝膠及玻璃表面剩余的水 .將 梳子 置于玻璃盤頂部 ,將堆疊層凝膠澆注于分離膠 ,這一步使用吸液管很容易做到 ,使acrylamide 溶液進(jìn)入凝膠 . 設(shè)定蛋白質(zhì)凝膠 主要強(qiáng)調(diào)的一點(diǎn)是 ,除了像核酸凝膠一樣要清洗電泳孔外 ,去除底部間隔裝置必須清洗每一針頭沖洗其內(nèi)部氣泡 ,否則會干擾到電泳 .為解決這一問題 ,我的專用針孔是彎的 ,這樣一來 ,針頭就可以進(jìn)入到凝膠縫隙 .最后一個重要的注意事項(xiàng)是 ,凝膠使用的 buffer 不同于制膠使用的 buffer 而是 trisglycine buffer，其 濃度是 1X. 蛋白質(zhì)凝膠電泳 如人們所預(yù)期的 ,蛋白質(zhì)凝膠電泳跟核酸凝膠電泳方法很相似 ,樣品配制時用裝載的 buffer 稀釋使 buffer 的終濃度為 90176。 pH 250 mM Glycine % SDS pH = without adjustment To make a 5X stock (1L): g Tris base g Glycine g SDS ~850 ml ddH2O 4. Protein Gel Sample Loading Buffer 50 mM TrisHCl。 C輕輕旋轉(zhuǎn) 3個小時 . ,集中在 510倍仲丁醇、乙醚提取兩次 . 離心后用丁醇有助于提取分離階段 ,并得到較高產(chǎn)量 4176。 C。l M EDTA 40 181。50 毫米的 EDTA,1%SDS 溶液 . 第 1天 12克肝臟冰凍 . (本組織應(yīng)已被分割成大約 188。d to with HCl. ml 10% SDS (or g solid) ~400 ml of ddH2O 2. Separating Gel Buffer 375 mM TrisHCl。. Add another ul PMSF and incubate another 1539。 C左右 ) 可以有效融化那些在比較低的溫度下就可以退火的 DNA粘性末端 . Tom Knight 報(bào)道 ， igase 能抑制宿主菌的變形轉(zhuǎn)換。 C 20 min，然后取 2μ L (20 μ L)用于熱休克活化細(xì)胞是轉(zhuǎn)換 . Ligation efficiency was marginally decreased by ？？？？？？？？？？？ 1 hr 連接酶室溫酶切 100 ng 質(zhì)粒載體 插入 DNA: 載體的摩爾比例為 5:1 和 1:1 Ligation 效率 noticably 減少 (x100) ............. Ligation 粘性末端有一個比較大 的插入片段 ( kb 質(zhì)粒 + kb 插入 DNA片段） 平末端的連接 連接效率急劇 下降 (x10000)了 ..... PCR產(chǎn)物延伸階段盡量使用暴露于 ethidium 溴化物和紫外線的 DNA 碎片 ( 困難的避免但是衷心推薦 ) 使用 NEB 快速連接裝備 Notes 確定 buffer 完全融化而且溶解。 加 μ L ligase . 吸液加樣之前將 ligase 渦旋混勻 . 跟大多數(shù)的酶一樣， ligase 就像 glycerol 一樣易沾在加樣器吸頭上，因此吸取的時候?yàn)榇_定你只加了 1 μ L,只需將吸頭放在液體表面吸取即可 . 將這 10 μ L 溶液置 176。 T4 DNA ligase 10x T4 DNA Ligase buffer 去離子滅菌雙蒸水 純化的線性載體 ( H2O 或 EB ) 潔凈的線性插入物 (H2O 或 EB 中 ) 儀器 旋渦器 程序 10 μ L 連接混合物 ， 也普遍使用比較大的連接混合物 μ L 10X T4 連接 buffer 按 6:1 的摩爾比例插入宿主菌 (~10ng 宿主菌 ) 加入 μ l 宿主 ~插入體積 dd H2O μ L T4 連接酶 計(jì)算插入物數(shù)量 插入物與宿主菌的摩爾比例影響著接下來的連接酶反應(yīng)與宿主轉(zhuǎn)換步驟。典型來說，它對核酸分子粘性末端的連接作用比平末端更顯著。第二次的時候，我重復(fù)第一次的 PE 洗滌，以盡可能在干燥之前除去樣品中混雜的鹽。 我使用的是 minifuge 進(jìn)行凝固、洗濯。在下面的記錄中，你就可以知道為什麼他們推薦你應(yīng)該使用水而非 Buffer EB 洗脫樣品，即使你沒有考慮到保持樣品的序列 ,在水中洗脫仍然是很有好處的。 旋轉(zhuǎn)離心 60 秒以獲得比較好的擴(kuò)增產(chǎn)物。 將步驟 4 所得的上清液，緩慢倒入或逐滴加入 QIAprep 微柱或 pipetting 離心 30 ~60 S，去除flowthrough. 。 小心顛倒 tube 管。 (重要前言 ) 它包含有用的數(shù)據(jù)。 42 176。 Txn Electroporation 試劑 ： 新鮮備制的 PCR 產(chǎn)物 ~4 μ l 鹽溶液 1 μ l 稀釋的鹽溶液 1 μ l 滅菌蒸餾水定容到 5 μ l TOPO174。 Cloning 參考，如果您是第一次進(jìn)行 TOPO174。 如果模板 DNA 的初始量比較高 ,那么進(jìn)行 2535個循環(huán)就足夠了。 引物復(fù)性階段 通常最佳 的退火溫度比引物的 DNA Tm 低 5 176。如果要提高變性溫度 ,Taq DNA Polymerase 必須在變性結(jié)束后才能加入反應(yīng)體系中，否則超過 95 176。 * 循環(huán)條件 、引物和擴(kuò)增裝置。 保持 PCR 的最大忠誠性程度對反應(yīng)是非常重要的 , 而 dNTP 的最后濃度是 10500μ M時能夠滿足 DNA 綜合 性忠誠度達(dá)到最大的。 ，接著在 PCR 反應(yīng)板上滴加反應(yīng)終止液 . 試劑 終濃度 反應(yīng)體系總體積 50ul 滅菌蒸餾水 未知 10X Taq buffer 1X 5μ l 2mM dNTP 混合 引物 I 適量 引物 II 適量 Taq DNA 聚合酶 25mM MgCl2 14mM 適量 模板 DNA 10pg1μ g 適量 表為選擇 25mM MgCl2 的 反應(yīng) 容量 管 ： 反應(yīng)混合液中 MgCl2 終濃度 25mM MgCl2 加入量（μ l） 4 5 6 8 3. 柔和漩渦樣品并簡單驚醒離心分離收集沾在管壁所有反應(yīng)液 . 4. 用半容量的礦物油覆蓋樣品或增加適當(dāng)?shù)南喈?dāng)數(shù)量蠟。 這個技術(shù)敏感性意味著不應(yīng)該沾染樣品與也許在實(shí)驗(yàn)室里環(huán)境居住的任何其他脫氧核糖核酸或早先被放大的產(chǎn)品 (amplicons). 除了后來的反應(yīng)產(chǎn)品分析外， DNA 樣品準(zhǔn)備，反應(yīng)混合集合和 PCR 過程，都應(yīng)該在分開的區(qū)域進(jìn)行 。 建議使用裝備有紫外線燈的 Laminar 流程內(nèi)閣裝置來混合反應(yīng)試劑 . 應(yīng)該為脫氧核糖核酸洗凈和每個反應(yīng)設(shè)定佩帶新鮮的手套 . 進(jìn)行 DNA 樣品和反應(yīng)混合準(zhǔn)備時 , 我們強(qiáng)烈推 薦使用熱衷的船加樣槍及氣溶膠濾膜。 如果熱量 cycler 裝備一個激昂的盒蓋，這 一步 可 以省略。除此之外 , MgCl2 的濃度選擇主要是根據(jù)經(jīng)驗(yàn)而定 , 以 1mM 為起始體積每 mM 逐步增加 , 直到獲得一定產(chǎn)量的 PCR 產(chǎn)物。 起始變性階段 DNA 模板的完全變性 是 PCR 反應(yīng)的關(guān)鍵。 C 時酶的活性會迅速降低 . 變性階段 由于第一擴(kuò)增周期得到的 PCR產(chǎn)物通常都比模板 DNA 短，因此通常在 9495 176。 C 并孵育 min 就足夠了。 后續(xù)延伸階段 在最後一個周期之後，樣品通常置于 72 176。 Cloning，我們建議您按照手冊中所提供的詳細(xì)方案記錄進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 Vector 1 μ l 總體積