腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)林星石(參考版)
2025-05-18 01:25本頁(yè)面
【正文】 單克隆抗體免疫學(xué)測(cè)定 1. Ig單克隆抗體亞型測(cè)定 2. 單抗對(duì)應(yīng)抗原特性分析：理化性質(zhì)、 分子量。 ⑴ 24孔 板陽(yáng)性孔應(yīng)再分出 1孔，待第 2孔 生長(zhǎng)良好，長(zhǎng)滿孔底，收集第 2孔細(xì) 胞凍存。 7. 克隆化后 HT逐漸換成 RPMI1640， 1/2遞減 , FCS 濃度遞減 5%至 10%－ 15%。 單 克 隆 抗 體 制 備 5. 計(jì)數(shù)后從相應(yīng)孔取 100個(gè)細(xì)胞（如第 3孔細(xì)胞 計(jì)數(shù)為 10 3，則從第 3孔取 100/ 103 ≈），加入 10ml HT，接種預(yù)先加入滋 養(yǎng)細(xì)胞 96孔板， ，每孔約 1個(gè)雜交瘤細(xì) 胞，總量 。 3. 用 1ml吸管吹散待克隆的雜交瘤細(xì)胞，取適量加入含 ，混勻，吸 ，同法稀釋第 3孔、第 4孔。 1. 按前述準(zhǔn)備新鮮滋養(yǎng)細(xì)胞用 HT培基接種 96孔板， 。 陽(yáng)性孔雜交瘤轉(zhuǎn)入 24孔板， 1天后細(xì)胞狀態(tài) 好即可克隆化。 單 克 隆 抗 體 制 備 七 . 雜交瘤抗體檢測(cè)： 培基變黃，雜交瘤細(xì)胞占孔底面積 1/狀 態(tài)好，可測(cè)上清液抗體（非分泌性比分泌性雜 交瘤長(zhǎng)速快），及時(shí)測(cè)抗體及時(shí)克隆化，以免 目的雜交瘤丟失。記錄。 提示： 接種 10~12塊 96孔板，使 80%雜交瘤生長(zhǎng)為 單克隆，減少克隆化次數(shù)，陽(yáng)性孔不易丟失。 再補(bǔ)加 40 ml。 第 4 min 加 ml。 第 2 min 加 1 ml。 5 min內(nèi) 搖動(dòng)緩和 加入 10 ml 預(yù) 溫 37 ℃ 的 RPMI1640。 單 克 隆 抗 體 制 備 2. RPMI1640培基洗 2次（ 1500r /min/8min）； 3. 傾倒上清，吸盡殘留液，輕彈管底， 使細(xì)胞 疏松，離心管移至超凈臺(tái)預(yù)先放置的 37 ℃ 水浴。 單 克 隆 抗 體 制 備 五 . 細(xì)胞融合： 1. 將準(zhǔn)備好的骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞混合于 50ml離心管內(nèi)（脾細(xì)胞 1 10 8，骨髓瘤細(xì)胞 1 10 7）。用前 37 ℃ 預(yù)熱。 單 克 隆 抗 體 制 備 三 . 免疫脾細(xì)胞懸液制備： 5. 上述培基洗細(xì)胞 2次（ 1000r/min 10 min ）， 6. 不完全培基 10ml重懸液，臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)活 脾細(xì)胞數(shù)， 1 10 8 ~ 10 8 /只。 2. 浸泡于 75%乙醇 5~15分，入超凈臺(tái)，打開(kāi)腹腔（逐次換器械），取脾。 3. RPMI1640培基洗 3次（ 1000r/min 5min ) 單 克 隆 抗 體 制 備 注意事項(xiàng)： 1. 骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞活數(shù)應(yīng)在 〉 95%， 2. 無(wú)各種污染， 、生長(zhǎng)密度合適。 單 克 隆 抗 體 制 備 二 . 骨髓瘤細(xì)胞準(zhǔn)備： Sp2/0, NS1等 1. 復(fù)蘇， 20%FCSRPMI1640培基為好。 ⑷ 無(wú)血清培基洗 2次，細(xì)胞濃度 2 105/ml, ml / 孔 / 96孔，相當(dāng)于 2 104。 2. 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞制備滋養(yǎng)細(xì)胞 ⑴ 正常無(wú)感染 BALB/C小鼠，處死。 免 疫 方 法 4. 體外免疫： 分離小鼠脾細(xì)胞，置 10% ~ 20% FCS RPMI1640培基，加適量滋養(yǎng)細(xì)胞與抗原 （可溶性抗原 ~ 5 ?g/ ml；細(xì)胞性抗原 10 5~106/ ml）， 37℃ ， 5%CO2 培養(yǎng) 3 天， 再分離淋
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