細胞培養(yǎng)相關技術ppt課件(參考版)
2025-05-06 03:43本頁面
【正文】 ? 二抗是熒光抗體，因此孵育時注意避光 ? 一抗室溫孵育 1h， PBST洗滌 3 5mim ? 二抗室溫孵育 1h， PBST洗滌 3 5mim ? 核染：可在 PBST第二次洗滌時在 PBST中加入核染料如DAPI（ 儲存液用蒸餾水配成 1mg/ml的濃度，使用終濃度一般為 ~1μg/ml ） 封片及熒光觀察 ? 為了保存結果，以便進一步觀察、照像、統(tǒng)計分析等，需作封片（ mounting）處理 ? 常規(guī)的方法是采用甘油或中性樹脂封片，為了增強封片的效果，往往需要在封片時添加特殊的抗熒光淬滅劑 ? 商業(yè)化的 Mounting buffer有的已含有 DAPI，染核在封片時即完成 抗體選擇 ? GFP + TRITC目標蛋白 +DAPI ? FITC目標蛋白 1+TRITC目標蛋白 2+DAPI，應注意目標蛋白 1和 2的熒光標記偶聯(lián) 2抗的匹配 GFP Mouse βcatenin DAPI Mouse βcatenin Rabbit ECSM2 DAPI 。適于胞質抗原或者質膜上靠近胞質一面的抗原，也適于可溶性的核抗原。 Triton X100是最常用的通透劑，但是它將破壞細胞膜，因此不適用于細胞膜相關抗原。 ? Triton和 NP40屬于烈性去垢劑，可部分溶解細胞核膜，因此非常適合核抗原檢測。 GFP TRITCphalloidin DAPI 58,60,61 62,64,65 80,81,82 間接免疫熒光染色 ? 制片 ? 細胞接種 ? 固定 ? 破膜 ? 封閉 ? 染色 ? 封片和熒光顯微鏡觀察 制片 ? Chamber slide：腔室玻璃系統(tǒng) ? Coverslip：蓋玻片（酒精，紫外照射滅菌） ? 玻片包被：膠原，纖維蛋白 fibronectin，整合素intergrin， vitronectin… *有些基質蛋白是與細胞內(nèi)某些信號通路相關的 Chamber slide 細胞接種 ? 根據(jù)不同的研究內(nèi)容和實驗目的，選擇不同細胞密度進行接種和生長時間 ? 染色前用溫熱的 PBS洗去培養(yǎng)基（含 Ca2+、 Mg2+ 或者不含 Ca2+、 Mg2+的 PBS的選擇） 固定 ? 根據(jù)需要選擇適當?shù)墓潭▌┕潭毎?，?4% 多聚甲醛 固定 15分鐘 ? 多聚甲醛宜現(xiàn)用現(xiàn)配，或配好后分裝 20 ℃ 凍存，用之前 37 ℃ 復溫 ? 固定完畢后的細胞可置于含疊氮納的 PBS中 4℃ 保存 3個月 ? PBS洗滌 3 5 min 破膜或通透 ? 在檢測細胞內(nèi)抗原表位的時候需要對細胞進行通透處理，因為抗體需要進入細胞內(nèi)部去檢測蛋白 ? 如果待檢測的是跨膜蛋白，且其抗原表位處于胞質內(nèi)區(qū)域，則同樣需要對細胞進行通透 ? 如果所檢測的抗原表位位于膜蛋白的胞外段，則不需要進行通透?？膳c F肌動蛋白結合，使 F肌動蛋白保持穩(wěn)定。缺點是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。 ? 直接法：將熒光素標記在相應的抗體上，直接與相應抗原反應。 ? 對一些內(nèi)毒素敏感的細胞（如原代細胞，懸浮細胞和造血細胞）， QIAGEN還提供可去除內(nèi)毒素污染的質粒抽提試劑盒，在質粒抽提過程中有效去除脂多糖分子，保證理想的轉染效果。 ? DNA質量 ? 一般的轉染技術（如脂質體等）基于電荷吸引原理，如果 DNA不純，如帶少量的鹽離子、蛋白、代謝物污染都會顯著影響轉染復合物的有效形成及轉染的進行。血清質量的變化直接影響轉染效率。外源 DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉染細胞能整合，通常需要通過選擇性標記篩選，如抗生素篩選 APH（新霉素抗性基因）， HPH （潮霉素）， TK（胸苷激酶）等反復篩選，得到穩(wěn)定轉染的同源細胞系。一般來說，在轉染后 2496小時內(nèi)檢測和分析結果。 轉染和轉化的區(qū)別 ? 轉化特指將質粒 DNA
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