腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)林星石-資料下載頁(yè)
2025-05-14 01:25本頁(yè)面
【正文】 00r /min/8min）； 3. 傾倒上清，吸盡殘留液，輕彈管底， 使細(xì)胞 疏松，離心管移至超凈臺(tái)預(yù)先放置的 37 ℃ 水浴。 4. 1 ml 吸管吸取 ml 37 ℃ PEG， 1 10 8 脾細(xì)胞 + ml PEG，邊加邊搖， 60s內(nèi)加完， 輕搖 min。 5 min內(nèi) 搖動(dòng)緩和 加入 10 ml 預(yù) 溫 37 ℃ 的 RPMI1640。 單 克 隆 抗 體 制 備 注意： 第 1 min 加 1 ml。 第 2 min 加 1 ml。 第 3 min 加 ml。 第 4 min 加 ml。 第 5 min 加 5 ml。 再補(bǔ)加 40 ml。 離心： 1000r / min / 5min. 單 克 隆 抗 體 制 備 5. 移出上清，取少量 HAT小心吹散細(xì)胞，細(xì) 胞移入 HAT培基中，按免疫脾細(xì)胞 2 10 5 / 孔 /96孔， 加入 ml ~ ml/孔（已加入融合當(dāng)天 制備的滋養(yǎng)細(xì)胞）， CO2 孵箱 37 ℃ 。 提示： 接種 10~12塊 96孔板，使 80%雜交瘤生長(zhǎng)為 單克隆，減少克隆化次數(shù)，陽(yáng)性孔不易丟失。 單 克 隆 抗 體 制 備 六 . 融合細(xì)胞觀察與換液： 1. 第 2~3天骨髓瘤細(xì)胞退化、核縮、碎裂， ?增生、吞噬碎片； 第 4~5天可見(jiàn)小堆 雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。記錄。 2. 融合后 5~7天確認(rèn)骨髓瘤細(xì)胞全部死亡， 毛細(xì)吸管吸出 ~ HAT， 換成同量 HT培基。 單 克 隆 抗 體 制 備 七 . 雜交瘤抗體檢測(cè)： 培基變黃，雜交瘤細(xì)胞占孔底面積 1/狀 態(tài)好，可測(cè)上清液抗體（非分泌性比分泌性雜 交瘤長(zhǎng)速快），及時(shí)測(cè)抗體及時(shí)克隆化，以免 目的雜交瘤丟失。 測(cè)定時(shí)間：融合后 10~15天，第２次換液 3 天后， ELISA、冰凍切片熒光技術(shù)等。 陽(yáng)性孔雜交瘤轉(zhuǎn)入 24孔板， 1天后細(xì)胞狀態(tài) 好即可克隆化。 單 克 隆 抗 體 制 備 八 . 克隆化：有限稀釋法。 1. 按前述準(zhǔn)備新鮮滋養(yǎng)細(xì)胞用 HT培基接種 96孔板， 。 2. 向 24孔板加 ml/孔 HT，通常每個(gè)待克隆雜交瘤需 3－ 4孔。 3. 用 1ml吸管吹散待克隆的雜交瘤細(xì)胞，取適量加入含 ，混勻，吸 ，同法稀釋第 3孔、第 4孔。 4. 混勻第 1孔細(xì)胞計(jì)數(shù)。 單 克 隆 抗 體 制 備 5. 計(jì)數(shù)后從相應(yīng)孔取 100個(gè)細(xì)胞（如第 3孔細(xì)胞 計(jì)數(shù)為 10 3，則從第 3孔取 100/ 103 ≈），加入 10ml HT，接種預(yù)先加入滋 養(yǎng)細(xì)胞 96孔板， ，每孔約 1個(gè)雜交瘤細(xì) 胞，總量 。 6. 9－ 10天 測(cè)抗體，陽(yáng)性孔轉(zhuǎn) 24孔板， 1－ 3天后第 2次 、 第 3次 克隆，直至陽(yáng)性率 100%。 7. 克隆化后 HT逐漸換成 RPMI1640， 1/2遞減 , FCS 濃度遞減 5%至 10%－ 15%。 8. 細(xì)胞凍存：陽(yáng)性雜交瘤盡早凍存。 ⑴ 24孔 板陽(yáng)性孔應(yīng)再分出 1孔，待第 2孔 生長(zhǎng)良好，長(zhǎng)滿孔底，收集第 2孔細(xì) 胞凍存。 ⑵ 建株后每株凍存 5－ 8管。 單克隆抗體免疫學(xué)測(cè)定 1. Ig單克隆抗體亞型測(cè)定 2. 單抗對(duì)應(yīng)抗原特性分析：理化性質(zhì)、 分子量。 3. 單抗等電點(diǎn)測(cè)定 4. 單抗親和力測(cè)定
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