實(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件(參考版)
2025-05-02 00:22本頁(yè)面
【正文】 ★ 如果細(xì)胞比較濃，可按 1:3分配傳代培養(yǎng)。 ★ 用無菌吸液管輕輕吹打，使 HL60細(xì)胞均勻懸浮 然后吸出一半的細(xì)胞懸液加人另一個(gè)培養(yǎng)瓶中。在放入液氮時(shí)，要帶手套操作以免凍傷?？傊陂_始時(shí)溫度下降速度不能超過 ﹣10℃ ／ min。 要適當(dāng)掌握降溫速度。裝入已做標(biāo)記的小袋或支架同時(shí)作好記錄。（ 4）凍存管用封口膠膜封口，同時(shí)注意凍存管必須旋緊確保密封。（ 3）加含 10％ DMSO凍存液 加入配制好的凍存培養(yǎng)液（含 10％ DMSO或甘油），凍存液中細(xì)胞的最終密度為 1～ 5 10 6／ ml左右。依據(jù)傳代方法把消化好的細(xì)胞收集于離心管加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液并計(jì)數(shù)，離心 1000 rpm／min2 min 。（圖）（ 1）取生長(zhǎng)狀態(tài)好的細(xì)胞即選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，已經(jīng) 長(zhǎng)滿 的細(xì)胞凍存?！? 酒精燈（或其他安瓶封口設(shè)備） 、封口膠等。★ 含 10％－ 20％ (胎牛 )血清培養(yǎng)液。這樣可以最大限度的保存細(xì)胞活力。 目前多采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑。如細(xì)胞內(nèi)冰晶形成較多，隨冷凍溫度的降低，冰晶體積膨脹造成 DNA的空間構(gòu)型發(fā)生不可逆的損傷性變化，而引起細(xì)胞的死亡。細(xì)胞膜上的類脂蛋白復(fù)合體在冷凍中易發(fā)生破壞引起胞膜通透性的改變、使細(xì)胞內(nèi)容物喪失。因?yàn)榧?xì)胞在直接冷凍時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外的水分都會(huì)很快形成冰晶，冰晶的形成將引起一系列的不良反應(yīng)。 細(xì)胞的凍 存 附 1◆ 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基配置方法 :1640粉 Hepes 葡萄糖 丙酮酸鈉 110mg NaHCO3 2g 雙（三）蒸水加至 1000ml附 2： ◆ 消化液配制方法：稱取 （活力為 1： 250），加100ml無 Ca2+、 Mg2+的 Hank’s 液 (或 PBS液 )溶解，濾器過濾除用前可在 37℃ 下回溫。 ★ 防止由于培養(yǎng) 細(xì) 胞 污 染等因素造成 細(xì) 胞系的絕 種 ，要及時(shí)凍存細(xì)胞。以免因消化過頭而產(chǎn)生過多的細(xì)胞碎片，影響細(xì)胞生長(zhǎng)。四、注意事項(xiàng) ★ 形成的單層細(xì)胞相互匯合，整個(gè)瓶底逐漸被覆蓋時(shí)要立即進(jìn)行分離培養(yǎng)，否則細(xì)胞會(huì)因生存空間不足或密度過大，營(yíng)養(yǎng)障礙，影響細(xì)胞生長(zhǎng)?！? 用吸管將貼壁的細(xì)胞吹打成懸液，分到另外兩到三瓶中，塞好橡皮塞（或瓶蓋），置37℃ 下繼續(xù)培養(yǎng)。觀察消化也可以用肉眼，當(dāng)見到瓶底發(fā)白并出現(xiàn)細(xì)針孔空隙時(shí)終止消化。 ★ 瓶口塞好橡皮塞，放在倒置鏡下觀察細(xì)胞。 三、操作步驟 ★ 將 長(zhǎng)滿 細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中原來的培養(yǎng)液棄去。 ★ 試劑： ％胰酶、 1640培養(yǎng)基（含 10％小牛血清）。懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以，而貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶。傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法。 ★ 離心后上清夜一定要吸干凈，以免因 DSMO的毒性造成細(xì)胞活力下降而難以復(fù)活。培養(yǎng)液、吸管、離心管、培養(yǎng)瓶、CHO/Hela細(xì)胞等。用品和試劑 這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化。如果細(xì)胞壓在格線上時(shí)，則只計(jì)上線，不計(jì)下線，只計(jì)左線，不計(jì)右線。 ，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其時(shí)多次取樣計(jì)數(shù)時(shí)更意每次取樣都要混勻，以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確； ，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計(jì)數(shù)。 鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。 將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。三、 操作步驟 試劑 ： SP20細(xì)胞、 ％臺(tái)盼（酚）蘭其配方是：臺(tái)盼（酚）蘭 100ml等。二、儀器、用品與試劑儀器與用品： 普通顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板、 EP管、毛細(xì)吸管等。 用臺(tái) 盼（酚） 蘭染細(xì)胞，死細(xì)胞著色，活細(xì)胞不著色，從而可以區(qū)分死細(xì)胞與活細(xì)胞。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。
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