【正文】 生根培養(yǎng)基均為 MS + IAA0. 5 mg/L 。 ? 何為細胞懸浮培養(yǎng)？怎樣做到懸浮培養(yǎng)細胞的同步化 ? 以番茄合作 908為植物材料，以葉片做外植體，簡要說明番茄葉片組織培養(yǎng)及其再生植株的過程。 ? ? 兩種途徑： ? 誘導愈傷組織，通過先芽后根的途徑發(fā)育成完整植株。 ? 細胞分裂與生長 ? 一般原生質(zhì)體培養(yǎng) 27天后 ,開始第一次分裂 ,但開始第一次分裂的時間隨植物的種類 ,分離原生質(zhì)體的材料 ,原生質(zhì)體的質(zhì)量 ,培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件而異 . ? 用幼苗的下胚軸和子葉、幼根、懸浮培養(yǎng)的細胞、未成熟種子的子葉等為材料分離的原生質(zhì)體 ；一般比用葉肉分離的原生質(zhì)體容易誘導分裂，第一次分裂出現(xiàn)的時間較快。 ? 缺點：不易觀察細胞的發(fā)育過程。 即在培養(yǎng)皿低部鋪一層瓊脂糖固體培養(yǎng)基，再將原生質(zhì)體懸浮液滴于固體培養(yǎng)基表面。 ? 缺點：操作要求嚴格，尤其是混合的溫度掌握必須合適，溫度偏高則影響原生質(zhì)體的活力，溫度偏低則瓊脂糖凝固太快，原生質(zhì)體不容易混合均勻。此外，難以跟蹤觀察某一個細胞的發(fā)育情況。一般直徑 3cm加 ，6cm加 23ml,510天后開始原生質(zhì)體分裂 ? 優(yōu)點：操作簡單，原生質(zhì)體代謝物易擴散，防止有害物質(zhì)積累過多造成毒害，易于添加新鮮培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物。 染色識別 ? A: FDA法： FDA本身沒熒光，進入細胞后被脂酶分解為具熒光的極性物，不能透過質(zhì)膜，而是留在細胞內(nèi)發(fā)光。 ? 熒光染色法： ? 用熒光增白劑溶液對原生質(zhì)體染色，在熒光顯微鏡下觀察，綠色顯示纖維素的存在，紅光是沒纖維素的真正原生質(zhì)體 ? 二、活力測定 目測法： 在顯微鏡下觀察，根據(jù)細胞形態(tài)、流動性確定原生質(zhì)體活力。再將原生質(zhì)體重新懸浮于洗滌液中，離心收集沉于底部的原生質(zhì)體。 ? 原生質(zhì)體的收集純化方法 ? 離心沉淀法 ? 鎳絲網(wǎng)濾出液 置于離心管（離心 23分鐘，原生質(zhì)體沉于離心管底部，殘液碎屑懸浮于上清液） 棄去上清液 再把沉淀物重新懸浮于清洗培養(yǎng)基中（反復 3次） ? 漂浮法 ? 根據(jù)原生質(zhì)體來源不同，利用比重大于原生質(zhì)體的高滲蔗糖溶液，離心后使原生質(zhì)體漂浮其上，殘渣碎屑沉到管底。 ? 一步分離法。 ? 酶解： ? 兩步分離法。 ? 原生質(zhì)體分離（以葉片為例） ? 取材消毒： ? 酶解處理時把滅菌的葉片或子葉等材料下表皮撕掉，將去表皮的一面朝下放入酶液中。分離原生質(zhì)體最有效。 ? 原生質(zhì)體能比較容易攝取外來的遺傳物質(zhì)，作為理想的受體系統(tǒng)進行各種遺傳操作的研究， ? 原生質(zhì)體的分離與純化 原生質(zhì)體材料來源： ? 葉片，花瓣，果實組織，子葉等， 尤其是葉肉細胞及由各部分形成的培養(yǎng)細胞和懸浮細胞。 ? 特點： 無細胞壁障礙，可以方便的進行有關(guān)遺傳操作 具全能性，能人工培育發(fā)育成完整植株。 ? 培養(yǎng)技術(shù)的選擇 包括對反應器的選擇和對培養(yǎng)方式的選擇，就目前的技術(shù)基礎(chǔ)來講， 固定化培養(yǎng)是植物細胞規(guī)?；a(chǎn)較為理想的系統(tǒng)。 ? ③ 膜生物反應器 常用中空纖維和螺線式卷繞反應器。 優(yōu)點：單位體積容量大。 ? ② 填充床生物反應器： 細胞固定在膠粒、金屬或泡沫顆?；蜻B續(xù)多個網(wǎng)中，或位于支持物表面。 優(yōu)點：細胞包埋顆粒小，傳質(zhì)效率高。 ? 細胞固定化培養(yǎng)技術(shù)按照其支持物不同可以分為兩大類： ? 包埋式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物多采用瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽 b、聚丙烯酰胺等； ? 附著式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物采用尼龍網(wǎng)、聚氨酯泡沫、中空纖維等材料。 ? （ 3）細胞經(jīng)包埋后受剪切力損傷小。 ? * 細胞固定化具有以下意義： ? （ 1）細胞生長較慢，有利于次生代謝物的積累。 兩相培養(yǎng)技術(shù)：在培養(yǎng)體系中加入水溶性或脂溶性的有機物或者具有吸附作用的多聚化合物，是培養(yǎng)體系形成上下兩相，細胞在水相上生長，合成的次生代謝物質(zhì)分泌出后轉(zhuǎn)移至有機相中。 （ 4）相關(guān)代謝機制不清楚。 （ 2）培養(yǎng)液粘度增加，影響細胞吸收營養(yǎng)及氣體傳遞。先在細胞生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)大批量細胞，當細胞生長至合成產(chǎn)物的階段后，再將其轉(zhuǎn)入到產(chǎn)物合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 ? 有用次生代謝物質(zhì) ? （ 3） 培養(yǎng)方法 (兩階段培養(yǎng)工藝） ? 為了同時滿足細胞生長和產(chǎn)物合成的需要，通常需要在不同階段使用不同的培養(yǎng)基，即兩階段培養(yǎng) ? 兩階段培養(yǎng)方法： ? 一步法逐級放大：對于細胞生長與目的產(chǎn)物合成同步的類型，一般采用此方法建立大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)。 ? 通氣： KLa（體積氧傳遞系數(shù)，單位時間、單位體積氧量）：如在 15L的通風式反應器中培養(yǎng)的煙草細胞，當 KLa值在 5－ 10h1的范圍內(nèi)，隨著 KLa的增加，生物量和代謝產(chǎn)物也呈線性增加 ? 激發(fā)子 : ? 植物細胞次生代謝除了自身的遺傳或發(fā)育基礎(chǔ)外，通常還與誘導因子有關(guān)。 機械攪拌式生物反應器 氣動式生物反應器 ? 6. 植物細胞生物反應器大規(guī)模培養(yǎng) 培養(yǎng)細胞和次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的影響因素 ? （ 1）細胞遺傳特性 ? 分清代謝物的合成部位或貯藏部位。 ? 缺點：剪切力大。 ? 能重復地取得大量、均一的培養(yǎng)細胞，供生物研究之用。 連續(xù)培養(yǎng) 加入培養(yǎng)基 排出培養(yǎng)基及其培養(yǎng)物 二者體積相等 分 ：開放式連續(xù)培養(yǎng)（ Open ） 封閉式連續(xù)培養(yǎng)（ Closed ） 開放式和封閉式區(qū)別 ? 封閉式中：排出液中的細胞用機械方法收集后，又放入原培養(yǎng)基，所以其培養(yǎng)細胞數(shù)目不斷增加； ? 開放式中：在注入新鮮培養(yǎng)基的同時，培養(yǎng)細胞隨同培養(yǎng)液一起流出，培養(yǎng)細胞數(shù)目保持恒定；通過調(diào)節(jié)流入和流出的速度，使培養(yǎng)物的生長速度永遠保持接近最高值的恒定水平上。 繼代 最佳繼代時期： 了解細胞數(shù)目增長變化 S形曲線后，選擇對數(shù)生長期和直線 生長期！ ? （二）連續(xù)培養(yǎng) 連續(xù)培養(yǎng)反應器，在投料和接種培養(yǎng)后，以一定速度連續(xù)采集細胞與培養(yǎng)液，以同樣速度供給新鮮培養(yǎng)基，此種培養(yǎng)方式可使細胞生長環(huán)境長期維持穩(wěn)定 封閉式連續(xù)培養(yǎng)：系統(tǒng)中的細胞數(shù)目不斷增加。 ? （ 3）培養(yǎng)過程中，細胞生長，其數(shù)目不斷發(fā)生變化，呈 S增長。 ? 特點： ? （ 1）細胞生長在固定體積的培養(yǎng)基上，直至培養(yǎng)基中的養(yǎng)分為細胞耗盡為止。 （ 2）擴大培養(yǎng) ? 將優(yōu)良細胞株多次擴大繁殖得到大量細胞，用作生物反應器的種子 ? (3)生物反應器培養(yǎng) ? 培養(yǎng)方式 ? （一） 分批培養(yǎng) /成批培養(yǎng) ? 是指細胞接種到一定容積培養(yǎng)基的密封系統(tǒng)中培養(yǎng)， 它是進行細胞生長和細胞分裂的生理生化研究常用的培養(yǎng)方法。 （ 3）無性系的分離：將懸浮培養(yǎng)物經(jīng)過不銹鋼網(wǎng)過濾除去細胞塊，濃縮后接種與固體培養(yǎng)基上培養(yǎng) 2周。 ? 大規(guī)模細胞培養(yǎng)過程： （ 1）細胞的篩選與細胞株的建立（固液培養(yǎng)相結(jié)合） ? 篩選細胞株的方法是： （ 1）愈傷組織的誘導與培養(yǎng)：將切取得材料放在培養(yǎng)基上，愈傷組織形成后，繼代培養(yǎng)。 液體懸浮培養(yǎng)理論基礎(chǔ) 細胞生長曲線 ? 在整個培養(yǎng)過程中，細胞數(shù)目不斷發(fā)生變化，呈現(xiàn)出明顯的由慢到快，再到慢，最后增長停止的細胞周期。 3． 植物細胞培養(yǎng)過程中的氣體傳遞與影響 （ 1） 氧的傳遞 （ 2） CO2的影響 4． 泡沫與器壁表面黏附性 易產(chǎn)生泡沫 ， 與器壁表面黏附性強 ， 影響細胞生長 ， 要盡量消除 。 2． 植物細胞培養(yǎng)液的流變特性 易結(jié)團 ， 易分泌粘性物質(zhì) 。例如： 從胡蘿卜、萬壽菊提取色素 從黃菊提取芳香油 梔子提取果酸： 果酸含有大量的維生素，如維生素 C、檸檬酸等。 產(chǎn)品成分 用途 年銷售額（億美元） 長春花堿（長春花） 治療白血病 18～ 20（美國） 阿嗎靈 循環(huán)系統(tǒng)障礙藥 5～ 25（全世界） 奎寧（金雞納樹） 治療瘧疾 5～ 10（美國） 致熱素 殺蟲劑 20（全世界） 毛地黃 心臟病藥 20～ 55（美國） ? 許多植物次生代謝產(chǎn)物是優(yōu)良的食品添加劑和名貴化妝品原料。 ? 李時珍（ 1593）在 《 本草綱目 》 中所開列的 1892種藥物絕大多數(shù)是植物藥物，目前仍有約