細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)考題整理(參考版)
2025-03-28 07:10本頁面
【正文】 壓力不是有人比你努力，而是那些比你牛幾倍的人依然比你努力。最值得欣賞的風(fēng)景，是自己奮斗的足跡。不要做金錢、權(quán)利的奴隸；應(yīng)學(xué)會做“金錢、權(quán)利”的主人。贈(zèng)語； 如果我們做與不做都會有人笑，如果做不好與做得好還會有人笑，那么我們索性就做得更好，來給人笑吧！ 現(xiàn)在你不玩命的學(xué)，以后命玩你。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。經(jīng)過PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。1. Western Blot 原理在電場的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測。二、除實(shí)驗(yàn)樣品外，應(yīng)設(shè)幾種實(shí)驗(yàn)對照：1）陽性對照：陽性DNA模板參與的PCR反應(yīng)；陽性對照要選擇擴(kuò)增度中等、重復(fù)性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本。 3）嚴(yán)格按無菌操作原則進(jìn)行。所有的溶液都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染采取的措施：1）隔離不同的操作區(qū)。合適的退火溫度比引物本身的Tm低 5 ℃，一般在 55 ℃ 左右。8）引物的5’端可以修飾，如：引入酶切位點(diǎn)、啟動(dòng)子序列、用熒光素、生物素等標(biāo)記等。6）引物與非特異性序列的同源性不能超過70%或不能有連續(xù)8個(gè)堿基互補(bǔ)，否則導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。4）引物內(nèi)部不能存在互補(bǔ)序列，以避免形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。3）ATCG 4種堿基隨機(jī)分布，避免連續(xù)出現(xiàn)3個(gè)以上相同的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列，最好隨機(jī)分布。2）G+C含量一般占50％～60％，有利于引物與模板的結(jié)合。它能快速將皮克(pg)水平的DNA特異地?cái)U(kuò)增100萬倍左右，達(dá)到微克(μg)水平。 PCR DNA復(fù)制部位 DNA體外合成放大過程生物體內(nèi)DNA合成引物DNA引物 （作為新鏈的一部分）RNA引物（復(fù)制終止時(shí)被切除）催化酶 TaqDNA聚合酶有5’→ 3’核酸外切酶無3’ →5’核酸外切酶DNA聚合酶有5’ →3’核酸外切酶有3’ →5’核酸外切酶基本過程每循環(huán)一次包括變性、退火、延伸 復(fù)制起始、鏈延伸和終止三階段反應(yīng)實(shí)質(zhì)擴(kuò)增靶DNA合成子代DNA又稱體外DNA擴(kuò)增技術(shù)。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計(jì)引物做啟動(dòng)子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動(dòng)子的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。兩者本質(zhì)的區(qū)別是：SABC法的“三抗”是SABC復(fù)合物即鏈酶親和素－生物素－過氧化物酶復(fù)合物；而SP法的“三抗”是過氧化物酶直接與鏈酶親和素相連的，沒有通過生物素的中介連接。大量的酶將保證SABC 具有很高的敏感性。根據(jù)研究，SABC 大約可形成一百個(gè)左右的過氧化物酶和五十個(gè)左右的鏈霉親和素所構(gòu)成的復(fù)合物。而鏈霉親和素等電點(diǎn)接近中性,IP=~，對組織和細(xì)胞的非特異吸附很低，因而基于鏈霉親和素的免疫組化方法背景往往很低。同親和素一樣，對生物素分子有極高的親和力，是一般抗原抗體親和力的一百萬倍。SABC法：鏈霉親和素生物素復(fù)合物(strept avidinbiotin plex,SABC）法是一種顯示組織和細(xì)胞中抗原分布的簡便而敏感的免疫組化染色方法。最大的優(yōu)點(diǎn)是不受種屬的特異性限制。 SP法：是采用生物素標(biāo)記的第二抗體與鏈霉菌抗生物素蛋白連接的堿性磷酸酶及底物色素混合液來測定細(xì)胞或組織中的抗原。利用抗生物素分別連接生物素標(biāo)記的第二抗和生物素標(biāo)記的酶。℃孵育1520分鐘。 胰酶消化修復(fù)：（1：3），均勻混合。；將脫蠟水化后的組織切片置于不銹鋼或耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中。（16）飽和碳酸鋰水溶液返藍(lán)，水洗。（14）蘇木
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