細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)考題整理(編輯修改稿)
2025-04-21 07:10 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 =活細(xì)胞總數(shù)/（活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù)）*100%。 普通MTT法實驗步驟：：用含10%胎小牛血清的培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，以每孔100010000個接種于96孔板，每孔體積200ul。：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)35天（可以根據(jù)實驗?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)條件）。：培養(yǎng)35天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配成，pH=）20ul繼續(xù)孵育4小時，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150ul DMSO,脫色搖床振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。：選擇570nm（490nm）波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。 細(xì)胞冷凍方法：，將細(xì)胞懸液收集至離心管中。，棄上清液。，加含保護液的培養(yǎng)液，計數(shù)。，每管1ml。，寫上細(xì)胞種類，凍存日期?！姹?，約40min。 ℃冰箱，約3060min。 。 。 ，在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄。 細(xì)胞復(fù)蘇方法：1）從液氮中取出冷凍管，迅速投入37℃38℃水浴中，使其融化（1分鐘左右）；（2）5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上；（3）低速離心10分鐘；（4）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞。（細(xì)胞復(fù)蘇方法 實驗前準(zhǔn)備： ℃。％酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺臺面。、吸管、培養(yǎng)瓶等等。 取出凍存管：。，取出所需的細(xì)胞，同時核對管外的編號。 迅速解凍：，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化。，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內(nèi)。平衡離心：用架盤天平平衡后，放入離心機中3000r/min 離心3min 。制備細(xì)胞懸液： 。 ，吹打制成細(xì)胞懸液。 細(xì)胞計數(shù)： 細(xì)胞濃度以5105/ml為宜。 培養(yǎng)細(xì)胞 ：將復(fù)合細(xì)胞計數(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37℃和5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)24小時（或者2448小時）后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時間由細(xì)胞情況而定。 初學(xué)者易犯錯誤： 1水浴鍋未預(yù)熱或者未預(yù)熱到37℃。 ，導(dǎo)致傳熱不佳，使融化時間延長。，導(dǎo)致離心機損壞和細(xì)胞丟失。 ，忘記更換吸頭和吸管，導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。）免疫組化的定義、實驗步驟、分析、需要的試劑。免疫組化，是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理——抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(immunocytochemistry)。原理：抗體和抗原之間的結(jié)合具有高度的特異性，免疫組織化學(xué)正是利用了這一原理。先將組織或細(xì)胞中的某種化學(xué)物質(zhì)提取出來，以此作為抗原或半抗原，通過免疫動物后獲得特異性的抗體，再以此抗體去探測組織或細(xì)胞中的同類的抗原物質(zhì)。由于抗原與抗體的復(fù)合物是無色的，因此還必須借助于組織化學(xué)的方法將抗原抗體結(jié)合的部位顯示出來，以其達(dá)到對組織或細(xì)胞中的未知抗原進行定性，定位或定量的研究。實驗步驟（1）使用多聚賴氨酸防脫載玻片貼4μm石蠟切片。（2）58℃烤片4小時。（3）切片脫蠟至水。（4）蛋白酶消化或抗原熱修復(fù)（此步視一抗及組織具體情況而定）。（5）PBS洗3min3次。（6）組織切片于室溫下置于3% H2O2水溶液中1520min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。（7）PBS洗3min3次。（8）滴加非免疫動物血清，室溫孵育20min，封閉抗體非特異性結(jié)合位點。（9）甩去非免疫動物血清，直接滴加適當(dāng)稀釋的特異性一抗， 37℃孵育90120min。（10）PBS洗3min3次。（11）滴加二抗（二抗操作步驟視選用的免疫酶組織化學(xué)方法而定）（12）PBS洗5min3次。（13）DAB或AEC顯色310min，顯微鏡下監(jiān)控顯色程度，水洗。（14）蘇木精復(fù)染，水洗。（15）1%
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