掌握層析chromatography的概念(參考版)
2025-05-16 10:53本頁(yè)面
【正文】 茨維特 在當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)中觀察到 6個(gè)色帶，它們分別是胡蘿卜素、葉黃素和葉綠素 A和 B。 把菊根粉或白堊粉（ CaCO3）裝在玻璃管中，將植物葉子的石油醚提取液倒入管中，然后加入石油醚淋洗。 3. 觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象 ， 并計(jì)算 Hb的洗脫體積（ Ve） 和 DNP魚精蛋白的 Ve。 2. 加樣：取樣品液 5滴即為上柱樣品。 [器材 ] 層析柱（ 25ml） 等 [試劑 ] ： DNP魚精蛋白 、 Hb G50 [操作 ] 1. 裝柱： 在層析柱的底部出口套上乳膠塑料管，向?qū)游鲋鶅?nèi)加蒸餾水趕走在層析柱的死體積和接口處的氣泡，在蒸餾水高度約占體積的 1/3時(shí)，關(guān)閉下端出口，自頂部緩緩加入已處理好的 Sephadex G50懸液，待底部凝膠沉積 1~2cm時(shí)，再打開(kāi)出口，凝膠加至凝膠沉積離層析柱口約 3cm即可。 ： 每種樣品分離所用的緩沖洗脫液應(yīng)根據(jù) 使樣品穩(wěn)定 的原則使用 。 柱短而粗 ,則易使樣品稀釋 ,柱長(zhǎng)而窄 ,則柱的管壁效應(yīng)較大 ,會(huì)造成拖尾現(xiàn)象 。 選擇何種凝膠以及它的型號(hào) ,這需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件 ,溶質(zhì)的分子量的大小和分離工作的目的而定 ,每種型號(hào)凝膠都有一定分離溶質(zhì)分子量的范圍 ,選擇的型號(hào)凝膠要能滿足實(shí)驗(yàn)要求 。 （ 商品名為 Sepharose) 它是一種 大孔凝膠 ,其工作范圍的下限幾乎是 Sephadex的上限 ,可分離 MW40萬(wàn)以上 的物質(zhì) ,因此可用來(lái)分離核酸及病毒 。 G類 Sephadex的型號(hào)表示 每克干凝膠吸水量 x10,如 G50表示每克干凝膠吸水量為 5ml。 OH 特點(diǎn)： Sephadex 的三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的網(wǎng)孔大小取決于交聯(lián)度 ,交聯(lián)度的大小可在合成 Sephadex 時(shí)控制加入交聯(lián)劑的百分比決定 .交聯(lián)劑的百分比高 ,交聯(lián)度大 ,網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)愈緊密 ,孔隙愈小 ,吸水后膨脹也愈小 ,機(jī)械強(qiáng)度高 ,分離物質(zhì)的分子量也小 。 對(duì)某些溶質(zhì)分子具有吸附作用 ,如 芳香族化合物與脂蛋白等 。 （二）缺點(diǎn) 樣品和洗脫液的 粘度很低 。 操作條件較溫和 ,不易引起生 物物質(zhì)的變性 ,即使用來(lái)分離一些理化性 質(zhì)不穩(wěn)定的物質(zhì)也很少被破壞 。 Ve與 MW的關(guān)系 對(duì)同一類型的化合物 ,洗脫特性與組分的分子量有關(guān) ,流過(guò)凝膠柱時(shí) ,按分子量 (MW)大小順序流出 ,MW大的走在前面 ,Ve與 MW的關(guān)系可用下式表示 : Ve = K1 K2lgMW K1 K2 為常數(shù) , MW為分子量 三 .凝膠層析的特點(diǎn) （一）優(yōu)點(diǎn) 。 （ 4） Kd 1現(xiàn)象說(shuō)明凝膠對(duì)組分有吸附作用 ,此時(shí) VeVo + Vi,例如一些 芳香族化合物 的洗脫體積遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出理論計(jì)算的最大值 ,這些化合物的 Kd 1如苯丙氨酸 、 酪氨酸和色氨酸 。 Ve Vo Kd = ———— Vi （ 1） Kd = 0時(shí) ,Ve = Vo,意味著該分子完全被排阻于凝膠顆粒之外 ,全部分布于流動(dòng)相里 ,在固定相分布為 0,而 最先流出 。 ? Vo可用不被凝膠滯留的大分子物質(zhì)的溶液（ 最好有顏色以便于觀察如 Hb、 印度黑墨水 ）通過(guò)實(shí)際測(cè)
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