液相色譜技術(shù)chromatography(參考版)
2024-07-30 23:20本頁面
【正文】 . D a n i e l sso nThre e Pha se Stra tegy Ranking of Chr oma togra ph y Tec hniquesThre e Pha se Stra tegy Ranking of Chr oma togra ph y Tec hniquesTechnique Capture Interm ediate Polis hingGFIEXHICACRPCConside rationsLimite d sam ple v olumeLimite d flow rat e rang eProte in liga nd is sens itiv eto ha rsh cle aning cond itionsUse of ani c solv ents,loss o f biol ogica l activ it yTechnique Ppt HIC AIEX CIEX AC Purification factor 7 20 2408 18647 Porcine cerebella homogenate RESOURCE Q Ammonium sulfate precipitation Butyl Sepharose Fast Flow RESOURCE s HiTrap Heparin G Protein Receptor Kinase Purification Rec aMannosidase Purification from Pichia Technique Purification factor 63 622 719 UF GF AIEX HIC Phenyl Sepharose HP Q Sepharose FF Superdex 200 pg Ultrafiltration DNA Binding Protein Purification Technique DNA1 Sepharose CIEX AC AC AC CIEX Purification factor 5 8 4943 9 2447 HeLa cell nuclear extracts SP Sepharose High Performance Heparin Sepharose Fast Flow DNA2 Sepharose Mono S 思考題 ? 什么是色譜分離技術(shù)？ ? 色譜分離技術(shù)的分類？ 常用的蛋白質(zhì)分離方法有哪些？并簡述其原理 . ? 什么是色譜柱的理論塔板數(shù)以及如何計算理論塔板數(shù)？ ? 什么是吸附色譜及其分類和基本原理？ ? 什么是分配色譜？ ? 簡述高效液相色譜的工作原理？ ? 離子交換色譜的分類及應(yīng)用 ? 凝膠色譜的分離原理及分類 ? 離子交換及疏水作用色譜的原理 ? 高效液相色譜的分離原理及應(yīng)用？ ? 共價色譜的工作原理？ 。 ? 洗脫方式 ： pH梯度 離子強(qiáng)度梯度 色譜系統(tǒng) 高通量液相色譜系統(tǒng) 分析型色譜系統(tǒng) AKTA explorer 100色譜系統(tǒng) AKTA explorer 100色譜系統(tǒng)工作流程 HPLC HPLC AIEX Technique Ultrafiltration UF Superdex 200 . GF Purification factor Q Sepharose FF ? 10 times purification ? 82% yield Phenyl Sepharose HP HIC . Liao et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 28348 63 622 719 Purification of rebinant amannosidase from Pichia pastoris 多肽的分離純化 5 / S. R e nl und : P e pt i de s f r o m a l l s o ur c e s/ v e r . , 980610Separ ation t ec hniquesPe ptide Pr otei nRP C GFIE X IEXGF R P CPept ides from All S ourc esPept ides from All S ourc esHo w d oes a p ept id e d iff er fro m a pro tein ?6S t r a t e g y / A C / 1 9 9 8 / JB / 197。 ? 操作要點 蛋白質(zhì)的局部變性 洗脫采用逐步降低鹽濃度的方法進(jìn)行 ? 離子交換色譜是最常用的蛋白質(zhì)分離手段 操作要點： ? 由于蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在不同的 pH值下，其解離程度是不同的，因此既可以采用陽離子交換，也可以用陰離子交換，可視具體情況而定 ? 由于蛋白質(zhì)的極性基團(tuán)很多，為了避免洗脫困難，通常采用弱陽或弱陰離子交換劑 ? 適當(dāng)調(diào)節(jié)緩沖溶液的 pH值，使蛋白質(zhì)適當(dāng)解離，通常采用的 pH值靠近其等電點（不是等電點） ? 緩沖溶液的離子強(qiáng)度不能過高，通常在10~20m mol。 應(yīng)用舉例 ? 組織纖溶酶原激活劑（ tPA）的純化 ? 干擾素（ IFN）的純化 重組人白細(xì)胞干擾素，經(jīng)一步單抗免疫親和層析，rhIFNα比活提高了 1150倍，收率達(dá) 95%。 mpDudH E T P 2?目標(biāo)產(chǎn)物洗脫 ? 特異性洗脫 洗脫劑：含有與親和配基或目標(biāo)產(chǎn)物具有親和作用的小分子化合物 例：精氨酸溶液洗脫賴氨酸為配基親和吸附的 tPA 目標(biāo)產(chǎn)物洗脫 ?非特異性洗脫：調(diào)節(jié)洗脫液的 pH值，離子強(qiáng)度，離子種類或溫度等理化性質(zhì)。雜質(zhì)的非特異性吸附量與其濃度、性質(zhì)、載體材料、配基固定化方法等眾多因素相關(guān)。 目標(biāo)產(chǎn)物在親和介質(zhì)上的
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