【正文】 吸附平衡多用 Freundlich或 Langmuir型的等溫式表示。 間隔臂的作用 ? 當配基分子量較小時，為了排除空間位阻作用，需要在配基和載體之間連接一個 “ 間隔臂 ” ? 間隔臂的長度有一定限制，超過一定長度后，配基與目標分子的親和力會減弱 過程及影響 因素 ? 過程 ： 進料 → 清洗 → 洗脫 → 柱子再生。 親和吸附介質(zhì) 將親和配基共價偶聯(lián)在固體粒子表面（孔內(nèi)）即可制備親和吸附介質(zhì) ? 具有親水性多孔結(jié)構(gòu)，無非特異性吸附； ? 物理和化學穩(wěn)定性高，有較高的機械強度 ? 含有可活化的反應(yīng)基團 ? 粒徑均一的球形粒子 親和配基固定化 ? 親和配基的固定化方法 ? 介質(zhì)的活化 溴化腈活化法： NH2， 在堿性條件下完成。 ? 肝素：哺乳動物的臟器內(nèi)的酸性多糖物質(zhì)。 Reactive Blue 2 與脫氫酶，激酶結(jié)合。 ? 輔酶和磷酸腺苷：輔酶 I，與脫氫酶，激酶結(jié)合。 ? 凝集素：與糖特異性結(jié)合的蛋白。 L+E?E 〃 L ? 解離常數(shù)： Kd=[E][L]/[EL] 結(jié)合常數(shù)： Ka=1/Kd=[EL]/[E][L] 親和體系的結(jié)合常數(shù)為 104108dm3/mol 親和層析原理 親和層析是利用偶聯(lián)親和配基的親和吸附介質(zhì)為固定相親和吸附目標產(chǎn)物，使目標產(chǎn)物得到分離純化的液相層析法 親和層析 操作過程 親和配基 ? 酶的抑制劑 : 大豆胰蛋白酶抑制劑 ? 抗體：抗體 抗原， Ka=1071012。 1967年， Axen等利用溴化腈活化瓊脂糖凝膠成功制備了親和吸附介質(zhì)，使親和層析技術(shù)從研究走向?qū)嵱?。生物分子間的這種特異性相互作用稱為親和作用。 [有機溶劑 ] 親和色譜 （ Affinity chromatography） 載體活化、配基連接、吸附、洗脫 A C v er 990326 30Steric considerations amp。m 5181。 30181。 溶質(zhì)在介質(zhì)上的分配系數(shù)處決于溶質(zhì)的疏水性 ， 疏水性大 ， m高 。 反相色譜 reversed phase chromatography, RPC 固定相： 非極性的反相介質(zhì) ， 即為疏水性介質(zhì) (R1,R2多為甲基 ， R為 C4，C8， C18烷基或苯基 ， 其中 C18硅烷化制備的試劑最多 ， 統(tǒng)稱為ODS – Octadecyl silica)。 3rd 可以通過調(diào)節(jié)疏水性配基鏈長和密度來控制吸附性能的大小 ， 因此可根據(jù)目標產(chǎn)物的性質(zhì)選擇適當?shù)奈絼?。 如方法得當 ， HIC與 IEC的分離效率相當 。 線性洗脫時間 定義： GH dI/dV離子強度梯度 (mol/l)， F流動相流量 (l/s). 利用 GH和 Ip關(guān)系圖及上述方程 ， 可算 tr ? ? ? ?? ?? ?umLFdVdIIItVVdVdIGHIprt 1/1 。 ? 同樣分為 Q系列和 P系列 Mini Q PC : Glutathione synthetase SDSPAGE Starting material Peak 2 操作 1st 恒定洗脫 (Sephadex常用 ) 缺點：洗脫體積大 ,溶質(zhì)洗脫不盡 2nd 線性梯度洗脫 (linear gradient elution) 線性梯度洗脫的優(yōu)缺點 優(yōu)點：流動相 I/pH 連續(xù)變化 ， 不易出現(xiàn)干擾峰 ， 操作范圍廣； 缺點：需要特殊的濃度梯度設(shè)備 ， 如 梯度混合器 。 m?離子強度無限大時的溶質(zhì)分配系數(shù) , 為靜電作用外的非特異性吸附引起的溶質(zhì)在交換劑上分配 。因此需濃縮單元操作。 ? 5th 分離機理簡單，操作參數(shù)少，易于放大。 2nd 除熱原 、 過敏原 如青霉噻唑蛋白 – Sephadex G25凝膠柱 。 2nd 因此 ， 一定料液時 ， 根據(jù)組分的 M選擇分級范圍較小的介質(zhì) ，提高 Rs和料液的處理量 。 經(jīng)驗表明 ， 料液與流動相的黏度比應(yīng)控制在 2以內(nèi) 。 但實驗表明 ， 當濃度較高時 ，洗脫曲線出現(xiàn)吐舌 、 拖尾 、 甚至雙峰；使 HETP極度上升 。 3rd 意義：為得到較高的分離度 ， 料液體積需根據(jù)溶質(zhì)的 m差別控制在適當?shù)姆秶鷥?nèi) ， 在不影響分離度的前提下取最大值 。 這主要由于分子的擴散影響 。 在 u = 0處 ， 直線交于點 2Dz/u。 tVV ??04)影響 GFC分離特性的因素 線速度： 1st HW40F凝膠的排阻極限小 ， 在該凝膠中蛋白質(zhì)的 m = 0， 故HETP = 2Dz/u (Dz ? udp) = 常數(shù) 。 空隙體積 (void volume)：凝膠之間的空隙體積 ，即 V0。 床體積 (bed volume)： 1g干燥 gel溶脹后所占有的體積 。 % 100干g e lg e l后g e l溶 脹WWW 干平衡吸水率 ??凝膠粒徑：軟 gel粒徑較大 ， 在 50150?m之間；硬gel較小 ， 在 550?m之間 。 溶脹率 /吸水率： 如 ， Sephadex G50的溶脹率 = 500 177。 分級范圍 (fractionation range)：能阻滯組分并且使組分相互之間得到分離的組分分子量范圍 。 介質(zhì)的類型： 1st Sephadex 2nd Sephacryl 3rd Superose/dex, Sepharose 4th Cellulose 5th TSKgel 凝膠介質(zhì)特征參數(shù) 排阻極限 (exclusion limit)：指不能擴散到凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部的最小分子的 M。對于組分 1和 2，兩峰距離 ? ?? ?12022 mmVVVV