液相色譜技術(shù)chromatography-在線瀏覽
2024-08-29 23:20本頁(yè)面
【正文】 G50的排阻極限為 30kD。如 ， Sephadex G50的分級(jí)在 。 30%。 粒徑越小 ， HETP越小 ，分離效率越高 。 如 ， Sephadex G50的床體積為 911 cm3/g干膠 。 空隙體積一般用平均分子量在 2022KD水溶性藍(lán)葡聚糖 (blue dextran)測(cè)定 。 2nd HW55F凝膠的排阻極限較大 ，在此 ， m 0, HETP ? u。 3rd 當(dāng) u cm/min, NaCl的HETP隨流速降低急劇增大 。 CuBuAHE T PH ???)(進(jìn)樣體積： 1st 在一定相對(duì)料液體積范圍內(nèi) ，HETP為常數(shù)； 2nd 但一定時(shí)間之后 ， HETP隨料液相對(duì)體積的增加而急劇增大 。 料液濃度 依據(jù) GFC的原理 ， tr和 HETP與濃度無(wú)關(guān) 。 這主要為樣品黏度高造成 。 分子量 M和分配系數(shù) m 1st 在 GFC分級(jí)范圍內(nèi) m與 M關(guān)系 此時(shí) ， 分離度方程為 方程示： b值越大 ， 即凝膠分級(jí)范圍越小 ， Rs越大 。 Mbam log??? ?? ? ? ?? ? bDB u dAdFmMMFLRmpps 1212/1/14l o g???凝膠的粒徑 1st dp?, HETP?.故 dp?是 N?的最佳途徑； 2nd dp?10倍 , 而 h和 v不變 ， u?10倍 ， HETP(=hdp) ?10倍 ， R?10倍 ? ?? ? ???????11302)(22FmFmFDuduDH E T PHepz5） 應(yīng)用 1st 分離純化 M： x0106， d: ； 種類：肽 、 脂質(zhì) 、 抗生素 、 糖 、 核酸 、 病毒 (50400nm)。 3rd脫鹽 /置換 buffer 4th M測(cè)定 原理： 挑 選 標(biāo) 準(zhǔn) 蛋 白 質(zhì) ： cyt C(12500), Mb(16900), 胰凝乳蛋白 (23200),卵白蛋白 (45000)和 Hb(64500). 條件：在凝膠介質(zhì)分級(jí)范圍內(nèi) . 作圖： Mbam log??6） 優(yōu)點(diǎn) ? 1st 如其他色譜相比 ， 操作簡(jiǎn)便 ， 介質(zhì)價(jià)廉易得；適合于大規(guī)模生產(chǎn)； ? 2nd 溶質(zhì)和介質(zhì)不發(fā)生任何形式的相互作用，故操作條件溫和，回收率接近 100%； ? 3rd 分離結(jié)束后，無(wú)須對(duì)分離介質(zhì)進(jìn)行清洗和再生，故容易實(shí)施循環(huán)操作，提高產(chǎn)品純度； ? 4th 作為脫鹽手段， GFC比透析法速度快，精度高；與超濾相比，剪切力小，蛋白質(zhì)的回收率高。 7）缺點(diǎn) ? 1st 分離僅限于分子量的差別，選擇性低，處理量少； ? 2nd 經(jīng) GFC洗脫后，產(chǎn)品被稀釋。 離子交換色譜 ? 以離子交換樹脂作為固定相，選擇合適的溶劑作為流動(dòng)相，使溶質(zhì)按照其離子交換親合力的不同而得到分離的方法 原理 (ion exchanger chromatography, IEC) 1st 荷電溶質(zhì)在離子交換劑上的分配系數(shù) m I離子強(qiáng)度； A和 B為常數(shù) , 均為 pH的函數(shù) ， 在物理意義上 ， B為溶質(zhì)的靜電荷數(shù)與交換劑的離子價(jià)數(shù)之比 (對(duì)于 pro,一般大于 10)。 2nd 意義： 對(duì)于 aa 調(diào)節(jié) I value 調(diào)節(jié) |pH – pI| value ??? mIAImB)(常用的離子交換樹脂 ? 葡聚糖凝膠型 DEAESephadex A25， QAESephadex A25， CMSephadex C25， SPSephadex C25 ? 纖維素系列離子交換劑 DEAESephacel Cellex系列 ? 瓊脂糖系列離子交換劑 Sepharose系列 Sepharose CL6B, Sepharose Fast Flow BioGel A 系列交聯(lián)瓊脂糖離子交換劑 ? Source 系列離子交換劑 ? 特點(diǎn)：介質(zhì)均勻、分辨率高、流速快、反壓低 ? 陽(yáng)離子交換樹脂 S系列 ? 陰離子交換樹脂 Q系列 ? MonoBeads 系列離子交換劑（ Pharmacia） ? 特點(diǎn)：介質(zhì)為親水性聚醚，具有和 Source系列相同的優(yōu)點(diǎn)，但動(dòng)態(tài)載量更大，壽命更長(zhǎng)。 3 rd 階梯洗脫法 (stepwise elution) 優(yōu)點(diǎn) ：無(wú)須特殊設(shè)備，操作簡(jiǎn)單； 缺點(diǎn) ：流動(dòng)相濃度不斷變化，易出現(xiàn)干擾峰，容易出現(xiàn)多組分洗脫峰重疊的現(xiàn)象。00????????????分離度和柱效 1st 分離度 意義 ： 4因素可控制 2nd 柱效 意義： mpDudH E T P 2?2 ?????????pmG H u dLDRI+dI I mi 富集效應(yīng) 011 umu ii ??應(yīng)用： 疏水性吸附色譜 (hydrophobic interaction chromatography, HIC) 原理 1)吸附 1st pro疏水性 2nd pro稀疏水性差異 3rd 原有吸附介質(zhì)的親水性 4th 親水性介質(zhì)的改造 2)影響 pro水化層因素 1st 水化層 (hydration shell) tight hydration shell( water/1g pro) loose hydration shell(2g water /1g pro) 2nd ionic strength 3rd |pH水 – pI| Value |pH水 – pI| Value? zeta電勢(shì) ? 水化層 ? 4th 增加親水性物質(zhì) 離子： SCN， ClO4， I 有機(jī)物：乙二醇 、 丙三醇等
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