【正文】 t ????分配系數(shù) m影響因素 ： 分子量 , 分子形狀 , gel孔徑結(jié)構(gòu)；與 pH, I, T無關(guān) . 2)凝膠介質(zhì) 對介質(zhì)的要求： 1st 親水性高； 2nd 表面惰性 ， 不發(fā)生化學(xué)和物理變化； 3rd 高穩(wěn)定性 ， 有較寬的 pH和 I適應(yīng)范圍； 4th 具有一定的孔徑分布； 5th 機械強度高 ， 耐高壓操作 ， 壽命長 。 分子篩色譜 : 從上可見 ， 凝膠過濾具有分子篩的作用 。 ? 按分離的壓力 高壓色譜 中壓色譜 低壓色譜 ? 按流動相分 氣相色譜 液相色譜 超臨界流體色譜 各類色譜技術(shù)及應(yīng)用 ? 凝膠過濾色譜 ? 離子交換色譜 ? 疏水色譜 ? 聚焦色譜 ? 反相色譜 ? 超臨界流體色譜 ? 羥基磷灰石色譜 ? 灌注色譜 ? 應(yīng)用 凝膠過濾技術(shù) 1)Gel filtration chromatography(GFC)原理 操作與原理：含有不同組分的溶液 ，通過網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠粒子 (a)，小分子擴散進入凝膠相 ， 大分子被排阻于凝膠相外 ， 加入洗脫劑后溶液向下推移 ， 大分子及剩余的小分子進入下層新的凝膠相中 ， 重復(fù)上述擴散和排阻 。 紙色譜和薄層色譜主要適用于小分子物質(zhì)的快速檢測分析和少量分離制備，通常為一次性使用，而柱色譜是常用的色譜形式，適用于樣品分析、分離。 紙色譜： 用濾紙做液體的載體，點樣后，用流動相展開，以達到分離鑒定的目的。 理論板當(dāng)量高度： 該段色譜柱的高度。 sdme VKVV ??? 理論板，理論板當(dāng)量高度（ HETP），理論塔板數(shù)（ N）、 反應(yīng)不同時刻溶質(zhì)在色譜柱中的分布以及分離度與柱高之間的關(guān)系。 ? 分離度 :又稱分辨率，用來表示兩種洗脫曲線相鄰的溶質(zhì)相互分離的程度。柱色譜中一般稱為洗脫劑，薄層色譜時稱為展層劑。它可以是固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些基質(zhì)能與待分離的化合物進行可逆的吸附，溶解，交換等作用。 色譜法的基本原理 ? 色譜法是利用混合物中各組分 物理化學(xué) 性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流過固定相，稱為流動相）中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動而達到分離的目的。他們首先提出了色譜塔板理論，以及其遠見卓識的預(yù)言。 ? 后來無色物質(zhì)也可利用吸附柱色譜分離。22 液相色譜技術(shù) Chromatography 背景 ? 色譜法也稱色層法，是 1906年俄國植物學(xué)家 Michael Tswett發(fā)現(xiàn)并命名的。他將植物葉子的色素通過裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開，由此得名為 “ 色譜法 ” （ Chromatography) 。 ? 英國生物學(xué)家 Martin和 Synge。 ? 1944年出現(xiàn)紙色譜以后，色譜法不斷發(fā)展，相繼出現(xiàn)薄層色譜、親和色譜、凝膠色譜、氣相色譜、高壓液相色譜（ HPLC）等。 慢 中等 快 色譜分離 Temporal course 淋洗液 ? 固定相 ：固定相是色譜的一個基質(zhì)。 ? 流動相 ：在色譜過程中，推動固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個方向移動的液體、氣體等，都稱為流動相。 ? 分配系數(shù) 可由 Langmuir方程得出 Kd分配系數(shù) q、 c溶質(zhì)在固相和液相中的濃度 cqKd ?? 保留時間 （ tR） 和保留體積（ VR） 反應(yīng)樣品在柱子中的保留或阻滯能力，是色譜過程的基本熱力學(xué)參數(shù)之一。 2121 )(2WWR RR?????兩個相鄰洗脫峰之間的距離與兩個峰寬的代數(shù)平均值 . ? 阻滯因子 Rf 阻滯因子是在色譜系統(tǒng)中溶質(zhì)的移動速度和標準物（與固定相沒有親和力的流動相 Kd=0）的遷移率之比 其意義在于體現(xiàn)某一種溶質(zhì)與固定相之間的親和力大小 . 遷移距離流動相在色譜系統(tǒng)中的溶質(zhì)的遷移距離?fRsdmmf AKAAR??? 洗脫體積 色譜柱中，使溶質(zhì)從柱中流出所需流動相體積，為洗脫體積 不同的溶質(zhì)，由于和固定相的親和力的不同，洗脫體積也有所差異。 理論板： 將溶質(zhì)達到一次分配平衡的色譜柱段 。 ? 理論板數(shù)的計算方法 22/1)(WtN R?2)(16bRWtN ?N理論塔板數(shù) tR保留時間 W1/2半峰寬 Wb峰底寬度 ?理論塔板高度： NLH ?L柱長 色譜分離方法的分類 色譜分離方法很多，種類有四、五十種 但常用于生物大分子分離的色譜方法，按機理分，有以下幾種： ? 按操作形式不同分類： 柱色譜： 將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個方向移動而達到分離。 薄層色譜： 將適當(dāng)粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙色譜類似的方法進行物質(zhì)的分離和鑒定。生物化學(xué)中常用的凝膠色譜、離子交換色譜、親和色譜、高效液相色譜等都通常采用柱色譜形式。 這樣最先流出的為最大的分子 ， 最后流出的為最小分子 ，分段收集可以獲得按分子量大小分布的各組分 。 分子篩凝膠色譜原理 分離關(guān)系：組分 0的 M最大，不能進入 gel，洗脫體積為空隙體積 V0；組分 t的 M最小，能進入到 gel的細孔中，其洗脫體積接近柱體積 Vt, 組分 12在 V0Vt之間 . 顯然， GFC能分離洗脫體積在 V0Vt之間的組分。 商品化的介質(zhì)均能滿足 14條的要求 。 如 ， Sephadex