凝膠層析ppt課件(參考版)
2025-05-06 18:09本頁面
【正文】 =589ml思考題2． 在 60cm 的凝膠柱中脫鹽時，就理論值而言，最 多加樣體積是多少毫升 ?。()2Vp=Vs=Vt/2 685001． 在凝膠層析柱中分離某有效成分時，洗脫體積為140ml， 其外水體積和總體積分別為 60ml和 200ml， 求分配系數(shù)是多少 ?思考題 解： Ve= Vo+ Kav （ Vt－ Vo ） 140= 60 + Kav （ 200－ 60） Kav= 解：最大理論加樣量 23240n 血清清蛋白（人） 524800n 糜蛋白酶原（牛胰） 13370n 肌球蛋白（鱈魚肌） 247500n 細(xì)胞色素 c（牛心?。?16900n 過氧化氫酶（馬肝） n 肌紅蛋白（馬心肌） 如 淀粉酶 ，能與葡聚糖凝膠形成絡(luò)合物，這種絡(luò)合物與酶 底物絡(luò)合物相似，因此在凝膠層析時有異常反應(yīng)用凝膠過濾法測定分子量的局限性2022年中科院考研題n 今有 a、 b、 c、 d四種蛋白質(zhì)，其分子體積由大到小的順序是 abcd，在凝膠過濾柱層析中，最先洗脫出來的蛋白質(zhì)一般應(yīng)該是（ a－ bVelgMVo/Ve）③ Ve/Vt： 簡化的洗脫體積，受柱的填充情況的影響較小 (M為分子質(zhì)量，常數(shù) a、 b、 c、 d均大于 0) 先做標(biāo)準(zhǔn)曲線，再在相同條件下測樣品 Kav=clgM=原理： 3．條帶扭曲 （ 1）膠面不平（ 2）樣品或洗脫液中有顆粒（ 3）裝柱不均勻4．分辯率不高 （ 1）裝柱不均勻 （ 2）樣品量過大（ 3）流速太快（ 4）柱不垂直或柱不合適（ 5）長菌 （ 6）柱下口軟管太長（ 7）膠不適當(dāng)原理： 鹽類小分子物質(zhì)進入凝膠篩孔，而大分子物質(zhì)則被排阻在外 （分子篩原理）優(yōu)點： 與透析相比，速度快，不會引起大分子物質(zhì)變性材料： 細(xì)顆粒葡聚糖凝膠 G25 二、脫鹽和濃縮凝膠過濾層析經(jīng)常遇見的問題 干法：用濃度逐步升高的乙醇洗凈凝膠，使其脫水收縮，再抽干乙醇，用 6080℃ 的暖風(fēng)吹干，在室溫下保存。（ 2）保存方法：在此情況下，如欲重復(fù)使用，就須進行再生處理。因此，當(dāng) Vp等于或大于 Vs時， A、 B兩種物質(zhì)就不能完全分開 (圖中 Ⅱ) 當(dāng) Vp＜ Vs時， A、 B兩種物質(zhì)就能分開 (圖中 Ⅰ ) 根據(jù) Ve = Vo + Kav（ Vi +Vg） 又 Vs = VeA－ VeB = （ KavA－ KavB ）（ Vi +Vg） A、 B兩種物質(zhì)能分開的最低限： Vp＝ Vs最大 Vs時的必要條件： ①K avA－ KavB 最大，為 1－ 0＝ 1 ② V i +Vg最大，一般為 Vt/2則： 最大理論加樣量 Vp＝ Vs＝ Vt/2 最大理論加樣量的計算粘度對柱層析的影響 樣品與洗脫液的黏度相當(dāng)為宜流速對洗脫曲線的影響 3.具體加樣體積由分配系數(shù) (Kav)或洗脫體積 (Ve)來決定加樣量 VeA、 VeB： 組分 A、 B的洗脫體積 KavA、 KavB：組分 A、 B的分配系數(shù) Vs： A、 B兩組分的洗脫體積之差（又稱為分離體積）Vs= VeA － VeB 當(dāng)樣品體積 Vp＝ Vs時，理論上的洗脫圖形是兩種物質(zhì)恰好分開 (圖中 Ⅲ) 。作制備、脫鹽用時，占 20～ 30％ 床體積越小、方法靈敏度越高時，加樣量越少 立即用試管收集，待紅色流盡，換試管收集。2. 加樣 ：取樣品液 5滴即為上柱樣品。 不能讓凝膠表面露出水面。；167。；167。裝柱注意點：167。G50懸液，待底部凝膠沉積 1~2cm時，再打開出口，凝膠加至凝膠沉積離層析柱口約 3cm即可。每種樣品分離所用的緩沖洗脫液應(yīng)根據(jù) 使樣品穩(wěn)定 的原則使用。量適當(dāng) , 40： 1,甚至 100： 1,層析柱體積一般大于樣品體積的 25倍。六 .其它條件選擇 缺點：對蛋白質(zhì)有吸附能力。在用其分離樣品過程中，溶液的酸堿度可在 pH312范圍內(nèi)變化，溶液中加入去污劑 (如 1％ SDS)和 (或 )解離劑 (如 8mol/L尿素、 6mol／ L鹽酸胍 )時，也不會影響分離效果。HR200/300/400/500 Superdex Superdex是由高交聯(lián)度多孔瓊脂糖與葡聚糖共價結(jié)合而
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