【正文】 特殊試劑和培養(yǎng)基的配制 ％ 氨芐青霉素溶液（鑒定菌株用，無(wú)菌配制） 稱取氨芐青霉素 40mg，用 ，保存于冰箱?；靹?，分裝在 100mL 三角瓶中， MPa 20 min 滅菌。 頂層培養(yǎng)基的成分及制備 頂層瓊脂 瓊脂粉 g 氯化鈉 g 加蒸餾水至 500 mL mmol／ L 組氨酸 —生物素溶液 (誘變?cè)囼?yàn)用 ) D生物素（分子量 244） mg L組氨酸（分子量 155） mg 加蒸餾水至 250 mL。 ％瓊脂培養(yǎng)基 瓊脂粉 g 加蒸餾水至 400 mL 融化后 20min 滅菌。 注： 1)待其他試劑完全溶解后再將硫酸鎂緩慢放入其中繼續(xù)溶解，否則易析出沉淀。 H2O） g 磷酸氫 二鉀（ K2HPO4） g 硫酸鎂 1) （ MgSO4 底層培養(yǎng)基所需試劑及配制方法如下： 磷酸鹽貯備液 磷酸氫鈉銨（ NaNH4HPO4 b．細(xì)菌活力鑒定。 3H2O） g 蒸餾水 500 mL 加熱溶解，調(diào) pH 至 ，分裝后 MPa 20 min 滅菌，普通冰箱保存?zhèn)溆?，保存期不超過半年。避免重復(fù)高溫處理，選擇適當(dāng)保存溫度和期限，如肉湯保存于 4℃不超過六個(gè)月，其它詳見下述各培養(yǎng)基及溶液說(shuō)明。 低溫高速離心機(jī)，低溫冰箱（ 80℃）或液氮罐，潔凈工作臺(tái)，恒溫培養(yǎng)箱，恒溫水浴，蒸氣壓力鍋，勻漿器等。某些需要代謝活化后才能使沙門氏菌突變型產(chǎn)生 回復(fù)突變，代謝活化系統(tǒng)可以用多氯聯(lián)苯（ PCB）誘導(dǎo)的大鼠肝勻漿（ S9）制備的 S9 混合液。 2 原理 鼠傷寒沙門氏菌的突變型（即組氨酸缺陷型）菌株在無(wú)組氨酸的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，在有組氨酸的培養(yǎng)基上可以正常生長(zhǎng)。 本 方法 適用于評(píng)價(jià)保健食品的致突變作用。2, 177。此劑量序列可排列如下： ???? t=0, 177。2, 177。此劑量系列排列如下： ?????100 10t t=0, 177。由中毒表現(xiàn)初步提示毒作用特征。對(duì)死亡動(dòng)物可作大體解剖。 中毒反應(yīng)觀察 給予受試物后，即應(yīng)觀察并記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的中毒表現(xiàn)和死亡情況。 用式（ 7）計(jì)算混合物的預(yù)期 LD50 值的比值，按比值判定作用的方式。 測(cè)定混合物的 LD50，用其它 LD50 測(cè)定方法時(shí)，可 以按各個(gè)受試物的 LD50 值的二分之一之和作為中組，然后按等比級(jí)數(shù)向上、下推算幾組，與單個(gè)受試物 LD50 測(cè)定的設(shè)計(jì)相同，如估計(jì)是相加作用，可向上、下各推算兩組；如能為協(xié)同則多設(shè)幾組；如可能為拮抗作用，則可向上多設(shè)幾組。 步驟 分別測(cè)定單個(gè)受試物的 LD50，方法同前。最大灌胃容量小鼠為 ml/20gBW，大鼠為 。 劑量：受試物最大使用濃度和灌胃體積（一個(gè)劑量組）。 最大耐受量試驗(yàn)： 適宜條件：有關(guān)資料顯示毒性極小的或未顯示毒性的受試物，給予動(dòng)物最大使用濃度和最大灌胃容量的受試物時(shí)，仍不出現(xiàn)死亡。 相當(dāng)于 LD84 及 LD16 的劑量均可從所作直線上找到。 2N 2SSE /? ........................................（ 6） 式中： N39。 劃出直線，以透明尺目測(cè)，并照顧概率。 作圖計(jì)算 將各組按劑量及死亡百分率，在對(duì)數(shù)概率紙上作圖。 劑量及分組：一般在預(yù)試得到的兩個(gè)劑量組之間擬出等比的六個(gè)劑量組或更多的組。 機(jī)率單位 對(duì)數(shù)圖解法 預(yù)試驗(yàn)：以每組 2－ 3 只動(dòng)物找出全死和全不死的劑量。 logLD50=XKd（∑ P－ ） ......................................（ 3） 式中：∑ P－－ 各組動(dòng)物死亡百分比之和，其它同式（ 2）。 . 按本試驗(yàn)設(shè)計(jì)且各級(jí)間劑量對(duì)數(shù)等距時(shí)，可用式（ 2）： )(2LDlog 150 ???? ii PPdXK ...................................（ 2） 式中： XK最高劑量對(duì)數(shù)，其它同式（ 1）。 LD50 的計(jì)算公式 根據(jù)試驗(yàn)條件及試驗(yàn)結(jié)果，可分別選用下列三個(gè)公式中的一，求出 logLD50，再查其自然數(shù)，即 LD50（ mg/kgBW， g/kgBW）。 劑量：將由預(yù)試驗(yàn)得出的最高、最低劑量換算為常用對(duì)數(shù)，然后將最高、最低劑量的對(duì)數(shù)差，按所需要的組數(shù)，分為幾個(gè)對(duì)數(shù)等距（或不等距）的劑量組。 寇氏（ Korbor）法 預(yù)試驗(yàn)：除另有要求外，一般應(yīng)在預(yù)試中求得動(dòng)物全死亡或 90％ 以上死亡的劑量和動(dòng)物不死亡或 10％ 以下死亡的劑量，分別作為正式試驗(yàn)的最高與最低劑量。但經(jīng)多年來(lái)的實(shí)際應(yīng)用與驗(yàn)證，同一受試物寇氏法所得結(jié)果極為相近。記錄死亡數(shù)，查表求得 LD50，并記錄死亡時(shí)間及中毒表現(xiàn)等。 正式試驗(yàn)：將動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房飼養(yǎng)觀察 3～ 5 天，使其適應(yīng)環(huán)境，證明其確系健康動(dòng)物后，進(jìn)行隨機(jī)分組。 3 為小，所以結(jié)果較為精確。 1， 177。 2，177。 常用劑量 系列： 10t t=0，177。如有相應(yīng)的文獻(xiàn)資料時(shí)可不進(jìn)行預(yù)試。觀察 2h 內(nèi)動(dòng)物的中毒表現(xiàn)。根據(jù) 24h 內(nèi)死亡情況，估計(jì) LD50 的可能范圍，確定正式試驗(yàn)的劑量組。也可一日內(nèi)多次給予（每次間隔 4～ 6 h ， 24 h 內(nèi)“好好學(xué)習(xí)天天向上” 打造中國(guó)最大的學(xué)習(xí)資源平臺(tái)！ 免費(fèi)培訓(xùn) : 免費(fèi)下載 : 不超過 3 次，盡可能達(dá)到最大劑量，合并作為一次劑量計(jì)算）。 容量：各劑量組的灌胃容量相同（ ml/kgBW），小鼠常用容量為 ml/20gBW；大鼠常用容量為 。 受試物的給予 途徑：經(jīng)口。但不能采用具有明顯毒性的有機(jī)化學(xué)溶劑。一般采用水或食用植物油作溶劑，可以考慮用羧甲基纖維素、明膠、淀粉等配成混懸液；不能制時(shí)，可其它形式（如糊狀物等）。動(dòng)物購(gòu)買后適應(yīng)環(huán)境 3－ 5 天。小鼠體重為 18～ 22g，大鼠體重為180～ 220g。 3 原理 經(jīng)口一次性給予或 24h 內(nèi)多次給予受試物后，在短時(shí)間內(nèi)觀察動(dòng)物所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)，包括致死的和非致死的指標(biāo)參數(shù)，致死劑量通常用半數(shù)致死劑量 LD50 來(lái)表示。其單位是 每公斤體重所攝入受試物質(zhì)的毫克數(shù)、克數(shù)或毫升數(shù)，即 mg/kgBW、 g/kgBW 或 ml/kgBW。 2 術(shù)語(yǔ)和定義 下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本方法。 2 保健食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)和方法 急性毒性試驗(yàn) 鼠傷寒沙門氏菌 /哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn) 骨髓微核試驗(yàn) 哺乳動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn) 小鼠精子畸變?cè)囼?yàn) 小鼠睪丸染色體畸變?cè)囼?yàn) 顯性致死試驗(yàn) 非程序性 DNA 合成試驗(yàn) 果蠅伴性隱性致死試驗(yàn) 體外哺乳類細(xì)胞（ V 79/HGPRT）基因突變?cè)囼?yàn) TK 基因突變?cè)囼?yàn) 30 天和 90 天喂養(yǎng)試驗(yàn) 致畸試驗(yàn) 繁殖試驗(yàn) 代謝試驗(yàn) 慢性毒性和致癌試驗(yàn) 日容許攝入量（ ADI）的制定 致突變物，致畸物和致癌物的處理方法 “好好學(xué)習(xí)天天向上” 打造中國(guó)最大的學(xué)習(xí)資源平臺(tái)！ 免費(fèi)培訓(xùn) : 免費(fèi)下載 : 一、急 性 毒 性 試 驗(yàn) Acute Toxicity Test 1 范圍 本方法規(guī)定了急性毒性試驗(yàn)的基本技術(shù)要求。 “好好學(xué)習(xí)天天向上” 打造中國(guó)最大的學(xué)習(xí)資源平臺(tái)！ 免費(fèi)培訓(xùn) : 免費(fèi)下載 : 第二部分 Part 2 評(píng)價(jià)方法 Assessment Methods “好好學(xué)習(xí)天天向上” 打造中國(guó)最大的學(xué)習(xí)資源平臺(tái)！ 免費(fèi)培訓(xùn) : 免費(fèi)下載 : 1 主題內(nèi)容與適用范圍 本方法規(guī)定了保健食品的安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)的項(xiàng)目和方法。此，隨著時(shí)間的推移很可能結(jié)論也不同。根據(jù)試驗(yàn)資料，進(jìn)行最終評(píng)價(jià)時(shí)，應(yīng)全面權(quán) 衡做出結(jié)論。然而，即使有了完整和詳盡的動(dòng)物試驗(yàn)資料一部分人類接觸者流行病學(xué)研究資料，由于人類的種族和個(gè)體差異，也很難做出保證每人都安全的評(píng)價(jià)。 綜合評(píng)價(jià)：在對(duì)保健食品進(jìn)行最后評(píng)價(jià)時(shí)，必須綜合考慮受試物的原料來(lái)源、理化性質(zhì) 、毒性大小、代謝特點(diǎn)、蓄積性接觸的人群范圍食品中使用量與人的可能攝入量及保健功能等因素，確保其對(duì)人體健康的安全性。 安全系數(shù)：將動(dòng)物毒 性試驗(yàn)結(jié)果外推到人時(shí)，鑒于動(dòng)物、人的種屬和個(gè)體之間的生物學(xué)差異，安全系數(shù)通常為 100，但可根據(jù)受試物的原料來(lái)源、理化性質(zhì)、毒性大小、代謝特點(diǎn)、蓄積性、接觸的人群范圍、食品中使用量和可能攝入及功能等因素來(lái)綜合考慮其安全系數(shù)的大小。 含乙醇的保健食品：對(duì)試驗(yàn)中出現(xiàn)的某些指標(biāo)異常改變，在結(jié)果分析評(píng)價(jià)時(shí)應(yīng)注意區(qū)分是乙醇本身還是其它成分的作用。 特殊人群和敏感人群：對(duì)孕婦、乳母或兒童食用的保健品，應(yīng)特別注意其胚胎毒性或生殖發(fā)育毒性、神經(jīng)毒性和免疫毒 性。 生理作用與毒性作用：對(duì)實(shí)驗(yàn)中某些指標(biāo)的異常改變，在結(jié)果分析評(píng)價(jià)時(shí)要注意區(qū)分是生理學(xué)表現(xiàn)還是受試物的毒性作用。 7 保健食品毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)時(shí)應(yīng)考慮的問題 試驗(yàn)指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和生物學(xué)意義：在分析試驗(yàn)組與對(duì)照指標(biāo)統(tǒng)計(jì)上差異的顯著性時(shí)，應(yīng)根據(jù)其有無(wú)劑量反應(yīng)關(guān)系、同類指標(biāo)橫向比較及與本實(shí)驗(yàn) 室的歷史性對(duì)照值范圍比較的原則等來(lái)綜合考慮指標(biāo)差異有無(wú)生物學(xué)意義。 “好好學(xué)習(xí)天天向上” 打造中國(guó)最大的學(xué)習(xí)資源平臺(tái)！ 免費(fèi)培訓(xùn) : 免費(fèi)下載 : 試驗(yàn)組與對(duì)照組 動(dòng)物腫瘤發(fā)生率雖無(wú)明顯差異，但試驗(yàn)組中發(fā)生時(shí)間較早。 試驗(yàn)組與對(duì)照組動(dòng)物均發(fā)生腫瘤，但試驗(yàn)組發(fā)生率高。若存在劑量反應(yīng)關(guān)系，則判斷陽(yáng)性更可靠。 最大未觀察到有害作用劑量大于或等于 100 倍者，則可考慮允許用于保健食品。 慢性毒性和致癌試驗(yàn) 慢性毒性試驗(yàn)所得的最大未觀察到有害作用劑量進(jìn)行評(píng)價(jià)的原則是： 最大未觀察到有害作用劑量小于或等人的可能攝入 50 倍者，表示毒性較強(qiáng)，應(yīng)放棄該受試物用于保健食品。 最大未觀察到有害作用劑量大于 100 倍而小于 300 倍者 ，應(yīng)進(jìn)行慢性毒性試驗(yàn)。若最小觀察到 有害作用劑量