【正文】 第四節(jié) 蛋白質(zhì)的測定方法 雙指示劑甲醛滴定法 思考題： 1 、 試述蛋白質(zhì)測定中 ， 樣品消化過程所必須注意的事項(xiàng) ， 消化過程中內(nèi)容物顏色發(fā)生什么變化 ？ 為什么 ？ 2 、 樣品經(jīng)消化進(jìn)行蒸餾前 ， 為什么要加入氫氧化鈉 ？ 這時溶液發(fā)生什么變化 ？ 為什么 ？ 如果沒有變化 ， 說明什么問題 ？ 須采用什么措施 ？ 3 、 硫酸銅及硫酸鉀在測定中起了什么作用 ？ 4 、 試述氨基酸態(tài)氮的測定原理 。 （ g/mol） 第四節(jié) 蛋白質(zhì)的測定方法 雙指示劑甲醛滴定法 5． 說明及注意事項(xiàng) （ 1） 此法適用于測定食品中的游離氨基酸 。 V1為用百里酚酞作指示劑滴定時消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積 （ ml） 。 第四節(jié) 蛋白質(zhì)的測定方法 雙指示劑甲醛滴定法 4． 計(jì)算 氨基酸態(tài)氮 （ %） = C為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度 （ mol/L） 。 2． 試劑 第四節(jié) 蛋白質(zhì)的測定方法 3． 操作方法 移取含氨基酸約 2030mg的樣品溶液2份 ， 分別置于 250mL錐形瓶中 ， 各加50mL蒸餾水 ， 其中 1份加入 3滴中性紅指示劑 ， 用 定至由紅變?yōu)殓晟珵榻K點(diǎn)；另 1份加入3滴百里酚酞指示劑及中性甲醛 20mL， 搖勻 ， 靜置 1分鐘 ， 用 準(zhǔn)溶液滴定至淡藍(lán)色為終點(diǎn) 。 當(dāng)假如甲醛溶液時 ， — NH2基于甲醛結(jié)合 ， 從而使其堿性消失 。 計(jì)算： 氨 基 酸 態(tài) 氮 =（ N V 100） /W 100 第四節(jié) 蛋白質(zhì)的測定方法 單指示劑甲醛滴定法： 雙指示劑甲醛滴定法 1． 原理 氨基酸具有酸性的 — COOH基和堿性的 — NH2基 。 （ 3） NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液 。 第四節(jié) 蛋白質(zhì)的測定方法 試劑： （ 1） 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑 ， 將甲醛用 1N NaOH溶液中和（ 淡蘭色 ） 。 第四節(jié) 蛋白質(zhì)的測定方法 氨基酸總量測定 單指示劑甲醛滴定法： 原理： 氨基酸具有酸 ， 堿兩重性質(zhì) ， 因?yàn)榘被岷?COOH基 ， 而 COOH基顯示酸性 ，又含有 NH2， NH2則顯示堿性 ， 由于 COOH基和 NH2的相互作用 ， 使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽 ， 當(dāng)加入甲醛溶液時 ， NH2與甲醛結(jié)合 ，其堿性消失 ， 破壞內(nèi)鹽的存在 ， 就可用堿來滴定 COOH基 ， 以間接方法測定氨基酸的量 ，反應(yīng)式以三種形式存在 。 第四節(jié) 蛋白質(zhì)的測定方法 氨基酸不是單純的一種物質(zhì) ， 用氨基酸分析儀可直接測定出 17種氨基酸（ 儀器價格昂貴 ， 不能普遍使用 ） ， 對于食品來說有時有很多種氨基酸可以同時存在于一種食品中 ， 所以需要測定總的氨基酸量 ， 它們不能以氨基酸百分率來表示 ， 只能以氨基酸中所含的氮 （ 氨基酸態(tài)氮 ） 的百分率表示 ， 當(dāng)然 ， 如果食品中只含有一種氨基酸 ， 如味精中的谷氨酸 ， 就可以從含氮量計(jì)算出氨基酸的含量 。 第四節(jié) 蛋白質(zhì)的測定方法 一、 凱氏定氮法 氨基酸總量測定 pro經(jīng)水解或酶解可由大分子變成小的 pro成分 ， 如水解后的產(chǎn)物經(jīng)胨 ，肽等最后成為氨基酸 ， 氨基酸是構(gòu)成pro最基本的物質(zhì) 。 第四節(jié) 蛋白質(zhì)的測定方法 一、 凱氏定氮法 K氏微量定氮儀法 K氏半微量定氮儀法 ( 3原理一樣 ) 操作方法大同小異 ， 半微量法消化后 ，定容 100ml， 然后吸 25ml蒸餾吸收液吸收 。 這時由于分解促進(jìn)劑與加入的硫酸銅反應(yīng) ， 生成氫氧化銅 ，經(jīng)加熱后又分解生成氧化銅的沉淀 ，有時 Cu離子與氨作用生成深蘭色的絡(luò)合物 。 第四節(jié) 蛋白質(zhì)的測定方法 一、 凱氏定氮法 ， PH試紙檢查餾出液是否為堿性 。 ， 過多的硫酸鉀會引起氨的損失 ， 這時會形成硫酸氫鉀 ， 而不與氨作用 ，因此當(dāng)硫酸過多底物被消耗掉或樣品中脂肪含量過高時 ， 要添加硫酸量 。 ， 如不容易呈透明溶液 ， 可將K氏燒瓶放冷后 ， 加入 30%過氧化氫催化劑 2~3ml， 促使氧化 。 第四節(jié) 蛋白質(zhì)的測定方法 一、 凱氏定氮法 (4）氨的蒸餾和吸收及滴定 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) ， 若是固體樣品應(yīng)事先研細(xì) ， 液體樣要混合均勻 。 第四節(jié) 蛋白質(zhì)的測定方法 一、 凱氏定氮法 (4） 氨的蒸餾和吸收及滴定 蒸餾有兩種 : 1 直接蒸餾 （ 裝置簡便 ，準(zhǔn)確性好 ） 2 水蒸汽蒸餾 蒸餾加 NaOH是 50%， 加的量為 H2SO4量的4倍 ， 硫酸量為 12ml， 則 NaOH為 12 4=48ml，而且一般高于這個理論值 ， 即加到 50~55ml，如果 NaOH量加的不夠就變成 H2S， H2S是強(qiáng)酸 ， 使顏色變紅 。 K2SO4和 H2SO4的添加比例是： 1g樣品 K2SO4： H2SO4=7g： 12ml 這種比例在國內(nèi)外都使用 ， 是公認(rèn)的 還有一種比例： K2SO4： H2SO4=10： 20ml 第四節(jié) 蛋白質(zhì)的測定方法 一、 凱氏定氮法 ② 催化劑 用作催化劑的有 Hg、 HgO、 Se， 硒化合物 ， CuSO TiO2， 對 Hg， HgO有毒但結(jié)果好 ，Se與 CuSO4得到結(jié)果是一種 ， TiO2， 的結(jié)果偏低 ， 采用不同的催化劑則消化時間不同 ， HgO消化麥子為 38， Se與 CuSO4消化麥子 55，TiO2消化麥子 70， 所以在給出測定結(jié)果時要注明催化劑的類型 。 （ 4） 硒粉和過氧化氫 ， 氧化汞都為催化劑 ，但為了防止污染通常采用硫酸銅 (5)50%NaOH的作用 第四節(jié) 蛋白質(zhì)的測定方法 一、 凱氏定氮法 各種試劑的作用 下面我就針對幾點(diǎn)來說明為何影響氨化完全和速度快的因素 （ 1） K氏燒瓶和取樣量 如果稱 1g以上的樣品 ， 就需要 K氏