【正文】 最后感謝青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，感謝食品科學(xué)與工程學(xué)院，感謝每一位老師對(duì)我的辛勤教導(dǎo)，感謝每一位同學(xué)、朋友對(duì)我的真誠幫助。 在實(shí)驗(yàn)及論文的完成中，感謝實(shí)驗(yàn)室的秦云師姐、郭芳 言 師姐、王玉榮師姐、謝麗蒙師姐、賈晨師姐和 張叢叢師姐提供的無私的的幫助和指導(dǎo)，給我的關(guān)心和支持，謝謝你們！特別是秦云師姐對(duì)我的實(shí)驗(yàn)的幫助和帶領(lǐng)，對(duì)我的關(guān)心，非常感謝！ 同時(shí)，感謝我的家人。特別是實(shí)驗(yàn)探索中出現(xiàn)的一個(gè)個(gè)未知問題都在王老師的耐心指導(dǎo)下得以解決。該畢業(yè)論文隸屬于第六屆創(chuàng)新立項(xiàng)成果的一部分，在長達(dá)一年的實(shí)驗(yàn)及形成成果發(fā)表論文的過程中，王老師陪著我們小組，陪著我一起成長，讓我學(xué)到了很多。 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 香菇多糖抗氧化增效劑的研究 16 致謝 本論文是在王 鳳 舞副教授的悉心指導(dǎo)下 完成的。綜合考慮，大棗多糖是三種物質(zhì)中對(duì)香菇多糖的最佳抗氧化增效物質(zhì)，且增效顯著。和 清除的能力較差，用量多，且沒有清除羥自由基的能力。和 4 結(jié)論 本研究表明，四種提取物皆具有一定的抗氧化能力 。清除能力和 OH of LNT and JDP pounds 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 香菇多糖抗氧化增效劑的研究 15 如圖 9 可知，在大棗：香菇質(zhì)量比為 3:7 時(shí)，羥自由基清除率最高 %，測(cè)定的數(shù)值具有波動(dòng)性沒有明顯的趨勢(shì)，但還是能發(fā)現(xiàn)大棗多糖可以在一定程度上提高香菇多糖的清除羥自由基的效果。 不同配比復(fù)合物 清除羥自由基能力測(cè)定 不同配比的香菇與大棗多糖混合物清除羥自由基能力見圖 9 所示。 清除率的峰值在 3:7 處，清除率為 %，其清除率按照兩者配比中香菇多糖占有量的減少，呈先升后降的趨勢(shì)，并且配比后每組的清除率都比香菇多糖對(duì)照組高，說明大棗多糖作為增效劑明顯提高香菇多糖清除DPPH 的能力 Fig. 8 Ability of scavenging DPPH 能力見圖 8 所示。 不同配比復(fù)合物 清除 DPPH以香菇多糖為對(duì)照組，可看出混合物在配比為 3:7 和 4:6 時(shí)還原能力高于香菇對(duì)照組 。 如圖可知 ， 在大棗 ： 香菇 質(zhì)量比 為 3:7時(shí) ， 出現(xiàn)吸光值的峰值，此時(shí)復(fù)合物的 還原能力最大 。 最佳 增效劑 與香菇多糖抗氧化配比實(shí)驗(yàn) 不同配比復(fù)合物 還原能力 的 測(cè)定 還原能力測(cè)定結(jié)果如圖 7 所示。 DPPH 清 除實(shí)驗(yàn)中對(duì)香菇多糖有抗氧化拮抗作用或無清除能力，推測(cè)可能是大豆多肽的加入反而稀釋了香菇多糖的濃度，減弱了其清除自由基能力。而大豆多肽僅在還原能力上對(duì)香菇多糖增效，在 DPPH 清除實(shí)驗(yàn)和OH。推測(cè)可能是三七皂苷的結(jié)構(gòu)對(duì)香菇多糖的結(jié)構(gòu)在清除 OH的效果提高了約 10%，由 SPSS軟件分析知大棗多糖對(duì)香菇多糖的 OH of the mixture of Len with JDP and PNS 注：采用 Duncan39。OH 清除能力的協(xié)同增效作用。OH 的 IC50值的 濃度分別配制大棗多糖、三七皂苷和香菇多糖溶液，后按照體積比 1:1 將 2 種物質(zhì)分別與香菇多糖復(fù)配。OH 清除能力實(shí)驗(yàn) 因?yàn)榇蠖苟嚯牟痪哂辛u自由基清除的能力，因而不進(jìn)行下一步的配比實(shí)驗(yàn)。的清除能力。但差異性大小由大棗多糖、三七皂苷、大豆多肽依次遞減。三組測(cè)試結(jié)果與香菇多糖之間DPPH而大豆多肽對(duì)香菇多糖的 DPPH of the mixture of Len with peptides, JDP and PNS 注：采用 Duncan39。 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 香菇多糖抗氧化增效劑的研究 12 badc010203040506070香菇多糖 香菇大豆 香菇大棗 香菇三七DPPH清除率 圖 5 大棗多糖、大豆多肽、三七皂苷與香菇多糖的復(fù)配物對(duì) DPPH 清除能力的協(xié)同增效作用。達(dá)到 IC50值時(shí)的濃度溶液， 再 按照體積比 1:1 將 3 種物質(zhì)分別與香菇 多糖復(fù)配。 三種提取物與香菇多糖復(fù)配物 DPPH其中香菇大豆組的還原能力測(cè)定值與其他組的香菇多糖組的顯著性差異最大。 cbad01香菇多糖 香菇大豆 香菇三七 香菇大棗吸光值A(chǔ)700 圖 4 大豆多肽、三七皂苷、大棗多糖與香菇多糖的復(fù)配物還原能力 Fig. 4 Reducing power of the mixture of Len with peptides, PNS and JDP 注：采用 Duncan39。以香菇多糖為對(duì)照，比較三種提取物對(duì)香菇多糖還原能力的協(xié)同增效作用。大棗多糖的抗氧化能力比香菇多糖稍低，大豆多肽的抗氧化能力在四種提取物中最低。香菇多糖和三七粗皂苷在三種抗氧化實(shí)驗(yàn)中均有較好的抗氧化能力，且后者在 清除能力和 OH 清除能力較差。OH 清除能力大小為：三七皂苷 香菇多糖 大棗多糖 大豆多肽。 表 2 四種物質(zhì)清除羥自由基能力 IC50值 Table 2 IC50 values of scavenging 根據(jù)四種提取物羥自由基清除能力曲線得到回歸 曲線 方程，計(jì)算出四種提取物 大棗多糖在 4mg/mL 后 香菇多糖及大棗多糖的 OH 清除能力均隨溶液濃度的增大而增大，三七皂苷在濃度 OH 清除能力，而大豆多肽不具有該活性。 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 香菇多糖抗氧化增效劑的研究 10 圖 3 香菇多糖、大棗多糖、三七皂苷對(duì)羥自由基的清除能力 Ability of scavenging 四種提取物清除羥自由基活性結(jié)果 香菇多糖、三七皂苷粗提物、大棗多糖和大豆多肽的 其中大豆多肽的 DPPHof all extracts 種類 回歸曲線方程 IC50/(mg/mL) 香菇多糖 y=++ R2= 大豆多肽 y=+ R2= 大棗多糖 y=+ R2= 三七皂苷 y=++ R2= 據(jù)圖 2 及表 1 分析得四種物質(zhì) IC50值大小為：香菇多糖 三七皂苷 大棗多糖大豆多肽，相同濃度下四種物質(zhì)的 DPPH 表 1 四種提取物 DPPH 清除率曲線的回歸方程可計(jì)算出這 4 種物質(zhì) DPPH 清除率隨濃度 的增加 變化緩慢，在 25mg/mL 時(shí)清除率達(dá)到 61%。大棗多糖和三七皂苷 DPPH清除能力均隨濃度的增大而增大。的清除能力 Ability of scavenging DPPH 清除率測(cè)定結(jié)果如圖 2 所示。 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 香菇多糖抗氧化增效劑的研究 9 四種提取物清除 DPPH結(jié)果表 明：在 A700 為 ~ 的范圍內(nèi)，在同一吸光值下所需各提取物濃度按三七皂苷、香菇多糖、大棗多糖、大豆多肽的順序遞增；在 A700為其他濃度時(shí)，四種提取物物也近似呈現(xiàn)類似變化趨勢(shì)。由圖 1 可知，四種提取物的還原能力在一定濃度范圍均與其濃度呈正相關(guān)。 3 結(jié)果與討論 四種提取物抗氧化能力的測(cè)定 四種提取物還原能力測(cè)定 香菇多糖、三七皂苷、大棗多糖、大豆多肽的還原能力測(cè)定結(jié)果見圖 1。能力和 最佳搭配物質(zhì)與香菇多糖的抗氧化最佳配比實(shí)驗(yàn) 根據(jù)提取物與香菇多糖的抗氧化配比增效實(shí)驗(yàn)，得到大豆多肽、三七皂苷和大棗多糖三種代表提取物中的最佳香菇抗氧化增效劑。測(cè)定混合物的還原能力、DPPHOH 清除能力下不同提取物的濃度。 提取物與香菇多糖配比增效實(shí)驗(yàn) 根據(jù)還原能力實(shí)驗(yàn)和自由基清除率實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得到具有相同還原能力和相同DPPHOH，亞鐵離子可被 清除羥自由基的活性 [31] 采用鄰二氮菲 亞鐵法。具體方法如下： 還原能力的測(cè)定 —— 鐵氰化鉀還原法 [29] 清除 DPPH 自由基能力 —— 改進(jìn)的 Nagai 法 [30] DPPH（二苯代苦味?；杂苫┦且环N很穩(wěn)定的自由基，在乙醇溶液中呈現(xiàn)深紫色，在 517nm 處有最大吸收峰。 和羥自由基 （根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)肽含量。取 20μL稀釋液，加 200μLBCA搖勻，平行三組，一組空白對(duì)照， 37℃ 下靜置 1h。 多肽含量測(cè)定 大豆多肽提取液采用 BCA法測(cè)定肽含量 [28]。標(biāo)準(zhǔn) 曲線 方程為： A=＋ (r2=） 。 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 香菇多糖抗氧化增效劑的研究 7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取 5mg 人參皂苷對(duì)照品，加乙醇定容至 5mL，配置成 1mg/mL 皂苷溶液。 四種提取物含量測(cè)定 多糖含量測(cè)定 香菇多糖及大棗多糖提取液經(jīng)淀粉 KI試驗(yàn)無顏色變化，采用硫酸 苯 酚法 [26] 測(cè)定其 多糖 含量。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白含量 [25] 測(cè)得濃度為 34μg/mL，取料液比 1: 30，調(diào) pH 至 ，溫度 60℃ ，加入 %的木瓜蛋白酶水解 2h， 100℃ ，5min 終止水解。離心后所得沉淀物即為大豆蛋白。 大豆多肽的制備（堿溶酸沉協(xié)同酶解法） 取 大豆粉，按料液比 1: 10 加入蒸餾水，用 NaOH 調(diào) pH 值為 ，水浴50℃ 振蕩 30min，冷卻，離心。合并提取液，在 50℃ 下 蒸發(fā) 濃縮 。 三七皂苷粗提物提?。ù继岱ǎ? 將三七放置在燒杯中，用蒸餾水浸泡 48 小時(shí)，粉碎成細(xì)小塊狀，過濾，濾渣放置烘箱中烘干， 將 濾液蒸發(fā)濃縮。 4000r/min 離心 10 分鐘，取上清液，醇沉，離心，取沉 淀物 。 大棗多糖提?。ㄎ⒉ㄝo助法） 干大棗切碎，在 60℃ 鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒重， 粉碎后過 60 目篩。冷卻至室溫后 4000r/min 離心，取上清液，醇沉，離心后取