蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能-wenkub.com
2025-04-30 07:58 本頁(yè)面
【正文】 一般采用 Edman降解法 ，用異硫氰酸苯酯進(jìn)行反應(yīng)，將氨基酸降解后，逐一進(jìn)行測(cè)定。 ?通常采用 2,4二硝基氟苯 （ DNFB） 法和肼解法分別確定蛋白質(zhì)的 N端和 C端氨基酸殘基 。 ? 超速離心也可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量 ， 蛋白質(zhì)的分子量與其沉降系數(shù)S成正比 。不同的蛋白質(zhì)分子所帶 電荷量 不同 ， 且分子大小 也不同 ， 故在電場(chǎng)中的移動(dòng)速度也不同 ， 據(jù)此可互相分離 。 2. 有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)： ?凡能與水以任意比例混合的有機(jī)溶劑 ，如乙醇 、 甲醇 、 丙酮等 ， 均可用于沉淀蛋白質(zhì) 。 ? 常用的中性鹽有： 硫酸銨 、氯化鈉、硫酸鈉等。 ? 變性后的蛋白質(zhì)由于疏水基團(tuán)的暴露而易于沉淀 ， 但沉淀的蛋白質(zhì)不一定都是變性后的蛋白質(zhì) 。 ?變性蛋白質(zhì)的性質(zhì)改變： ① 物理性質(zhì)：旋光性改變 ， 溶解度下降 ， 沉降率升高 ， 粘度升高 ， 光吸收度增加等； ② 化學(xué)性質(zhì)：官能團(tuán)反應(yīng)性增加 ， 易被蛋白酶水解 。 因此 ， 蛋白質(zhì)具有親水溶膠的性質(zhì) 。 （ 1） 高山適應(yīng)和肺氣腫的生理補(bǔ)償變化； BPG升高 。 BPG的別構(gòu)效應(yīng) BPG是血紅蛋白的負(fù)效應(yīng)物 。 ★ 正效應(yīng)物： 促進(jìn)活性部位與配基結(jié)合的別構(gòu)效應(yīng)物 。 ★同促效應(yīng)（同位效應(yīng)）： 一種配體的的結(jié)合對(duì)于其它部位結(jié)合同種配體的能力的影響，包括（正）協(xié)同效應(yīng)和負(fù)協(xié)同效應(yīng)。這種由于蛋白質(zhì)分子構(gòu)象改變而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子功能發(fā)生改變的現(xiàn)象稱(chēng)為變構(gòu)效應(yīng) 。 ?形成一定的幾何形狀，如細(xì)菌鞭毛。 ?維系蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)的是氫鍵 、 鹽鍵 、范氏引力 、 疏水鍵等非共價(jià)鍵 。 4個(gè) Pro殘基各自處在一個(gè)拐彎處 ， 另外 4個(gè)是 Ser、 Thr、 Asn、Ile。 ? 大的球形蛋白 (200aa以上 )， 常常含有幾個(gè)結(jié)構(gòu)域 ， 球狀蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)特征 含有豐富的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件 具有明顯的折疊層次 分子呈現(xiàn)球狀或橢球狀 疏水側(cè)鏈埋藏在分子內(nèi)部，親水側(cè)鏈暴露在外表 表面常常有空穴，配體結(jié)合部位（活性中心） 肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能： （ 1） 肌紅蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu) 哺乳動(dòng)物肌肉中儲(chǔ)氧的蛋白質(zhì) 。 結(jié)構(gòu)域間的裂縫 ， 常是酶的活性部位 ， 也是反應(yīng)物的出入口 ?★ EF手：鈣結(jié)合蛋白中，含有 HelixLoopLelix結(jié)構(gòu) ?★鋅指： DNA結(jié)合蛋白中， 2個(gè) His、 2個(gè)Cys結(jié)合一個(gè) Zn ?★ 亮氨酸拉鏈： DNA結(jié)合蛋白中，由亮氨酸倒鏈形成的拉鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu) 五、蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu) 三級(jí)結(jié)構(gòu)： 整個(gè)多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu) 、 超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域的基礎(chǔ)上盤(pán)旋 、 折疊 ， 形成的特定的整個(gè)空間結(jié)構(gòu) 。 結(jié)構(gòu)域一般有１００－２００氨基酸殘基 。 4. 無(wú)規(guī)卷曲： ?無(wú)規(guī)卷曲是指多肽鏈主鏈部分形成的無(wú)規(guī)律的卷曲構(gòu)象 。 回折部分所形成的一種二級(jí)結(jié)構(gòu) ， 其結(jié)構(gòu)特征為： ⑴ 主鏈骨架本身以大約 180176。 典型的 α螺旋用 ， 13表示氫鍵封閉的環(huán)包括 13個(gè)原子 。 , Ψ= 48176。 （ 5） 肽鏈中的肽鍵一般是反式構(gòu)型 ， 而 Pro的肽鍵可能出現(xiàn)順 、 反兩種構(gòu)型 ． ★ 多肽鏈可以看成由 Cα串聯(lián)起來(lái)的無(wú)數(shù)個(gè)酰胺平面組成 ★ 當(dāng) Φ(Ψ)旋轉(zhuǎn)鍵兩側(cè)的主鏈呈順式時(shí)，規(guī)定Φ(Ψ) =0176。 ★ 肽鍵的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： （ 1） 酰胺氮上的孤對(duì)電子與相鄰羰基之間形成共振雜化體 。 酰胺平面（肽平面） 1. 由于 C=O雙鍵中的 π電子云與 N原子上的未共用電子對(duì)發(fā)生 “ 電子共振 ” ， 使肽鍵具有部分雙鍵的性質(zhì) ， 不能自由旋轉(zhuǎn) 。 ?在近中性環(huán)境中 ， 蛋白質(zhì)分子中的酸性氨基酸殘基側(cè)鏈電離后帶負(fù)電荷 ， 而堿性氨基酸殘基側(cè)鏈電離后帶正電荷 ， 二者之間可形成離子鍵 。 ?氫鍵的鍵能較低 (~12kJ/mol)，因而易被破壞。 如：血紅蛋白在不同的脊椎動(dòng)物中都具有輸送氧氣的功能 ， 細(xì)胞色素在所有的生物中都是電子傳遞鏈的組分 。 ★ 羧肽酶法 （ Pro不能測(cè) ） 羧肽酶 A：除 Pro、 Arg、 Lys外的所有 C端 羧肽酶 B：只水解 Arg、 Lys N H2N… … … … … Val— Ser— Gly C 肽鏈的部分裂解和肽段的分離純化 （ 1） 、 化學(xué)裂解法 ① 溴化氰 — Met— X— 產(chǎn)率 85% ② 亞碘酰基苯甲酸 — Trp— X— 產(chǎn)率 70100% ③ NTCB（ 2硝基 5硫氰苯甲酸 ） — X— Cys— ④ 羥胺 NH2OH — Asn— Gly— 約 150個(gè)氨基酸出現(xiàn)一次 （ 2） 、 酶法裂解 ① 胰蛋白酶 Lys X (X ≠ Pro) Arg—— X ② 胰凝乳蛋白酶 Tyr—— X (X ≠ Pro) Trp—— X Phe—— X 胃蛋白酶 Phe(Trp、 Try、 Leu)—— Phe(Trp、 Try、 Leu) ③ Glu蛋白酶 Glu—— X （ Vs蛋白酶 ） ④ Arg蛋白酶 Arg—— X ⑤ Lys蛋白酶 X—— Lys ⑥ Pro蛋白酶 Pro—— X （ 4） 二硫鍵的確定 （ 對(duì)角線(xiàn)電泳法 ） 碘乙酰胺封閉 SH 胃蛋白酶酶解蛋白質(zhì) 第一向電泳 過(guò)甲酸氧化 — S— S— 生成 SO3H 第二向電泳 分離出含二硫鍵的兩條短肽 ， 測(cè)序 與拼接出的肽鏈比較 ， 定出二硫鍵的位置 。無(wú)色 PTH氨基酸，有機(jī)溶劑抽提，層析。 （ 7） 測(cè)定各個(gè)肽段的氨基酸順序 （ 8） 確定肽段在多肽鏈中的順序 。 （ 3）
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