【正文】 對(duì)在本次 實(shí)驗(yàn) 中， 向 提供幫助的胡夢(mèng)姣，王麗，闞飛等同學(xué)表示感謝。 此外， 郭 老師 嚴(yán)謹(jǐn)細(xì)致的治學(xué)態(tài)度 和勤奮踏實(shí)的工作作風(fēng)，給我留下了深刻的印象，默默感染并影響著我，讓我感慨頗多、受益匪淺。 淮海工學(xué)院二○○六屆畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 第 14 頁(yè) 共 16 頁(yè) 致 謝 本次 實(shí)驗(yàn) 得助于敬愛(ài)的郭金耀老師，在他的關(guān)懷和幫助下畫(huà)上了句號(hào)。 我國(guó)是 海洋 大國(guó)， 鹽藻資源很豐富。進(jìn)一步對(duì)胞外蛋白的遷移率 Rf值進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其中含有兩類主要的蛋白質(zhì)，并且 Rf值差距比較大，對(duì)其推測(cè)可能一類是鹽藻分泌的胞外蛋白質(zhì)，另一類是鹽藻破碎裂解出的蛋白質(zhì)，具體情況還需要進(jìn)一步的研究。膠槽 3 加 的 是 標(biāo) 準(zhǔn) 蛋 白 ， 標(biāo) 準(zhǔn) 蛋 白 電 泳 的 遷 移 距 離 （ 泳 距 ） 是, (由于標(biāo)準(zhǔn)樣蛋白量較少，故凝 膠 上蛋白顯色也較淡，凝膠實(shí)物經(jīng)復(fù)印成圖片后又因碳黑陰影的掩蔽使得打印圖3上色調(diào)更淺 )膠槽 5，6， 7， 8 加的是胞外蛋白樣品，電泳形成 3個(gè)電泳條帶，泳距分別是 mm， mm， mm。 表 8鹽藻胞外蛋白質(zhì)的含量 對(duì)照 重復(fù) 1 重復(fù) 2 重復(fù) 3 A595nm 0 蛋白質(zhì)含量（ mg/ml） 0 鹽藻胞外蛋白質(zhì)的 Rf值 通過(guò)薄板層析 如 圖 2可以看出鹽藻有兩類主要的胞外蛋白質(zhì)，并可以測(cè)量出 展層后斑點(diǎn)中心與原點(diǎn)之間的距離記做 X，原點(diǎn)與溶劑前緣之間的距離記做 Y，根據(jù) Rf=斑點(diǎn)中心與原點(diǎn)之間的距離記 /原點(diǎn)與溶劑前緣之間的距離，求出 兩類蛋白質(zhì)遷移率 Rf值 如 表 9，從這兩類蛋白質(zhì) 的 遷移率可以看出它們的分子量差距 比較大。 [21] 3 結(jié)果與分析 鹽藻胞外蛋白質(zhì)的含量 按照表 8 依次加入各種物質(zhì)，考馬斯亮藍(lán)由青灰色變成淡藍(lán)色。 表 7標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì) 分子量 (KD) 兔磷酸酶 牛血清蛋白 卵清蛋白 碳酸酐酶 溶菌酶 （ 17）電泳：連接電源，打開(kāi)電泳儀，開(kāi)始時(shí)電流為 10mA，待樣品進(jìn)入分離膠后，改為30mA，當(dāng)染料前沿至橡膠框底邊 處，大約 3h30min,停止電泳 ，關(guān)閉電源。 （ 14）按表 6 配制 5ml %的 濃縮膠，混勻后，用細(xì)長(zhǎng)頭的滴管將凝膠液加至已聚合的分離膠的上方，輕輕的將電泳梳子插入到濃縮膠內(nèi)，約 20min 后凝膠聚合，小心的拔取電泳梳子，用窄濾紙條吸去凹槽中多余的水分， 將 膠條取出，凝膠板換面 ， 將 Tris— 甘氨酸 電極 緩沖液 倒入電泳槽內(nèi)，應(yīng)沒(méi)過(guò)短板 ,即可準(zhǔn)備加樣 。通過(guò)硅膠帶將兩塊玻璃板緊貼于電泳槽 (玻璃板之間留有空隙 )，兩邊用夾子夾住。L1 甘氨酸緩沖液 ）：稱 ，甘氨酸 ，加入 SDS 1g，加重蒸水使其溶解后定容至 1000mL。L1 TrisHCl 緩沖液）： 用電子天平 稱 取三羥甲基氨基甲烷（ Tris） ， 置于燒杯中， 加少許重蒸水使其溶解，再加 1mol （ 7） 配制分離膠緩沖液（ L 1 HCl，調(diào) pH 至 ，最后用重蒸水定容至 100mL。 （ 4）配制 樣品溶解液：內(nèi)含 1%SDS， 1%巰基乙醇， 40%蔗糖， %溴酚藍(lán)， SDS 在低溫易析出結(jié)晶，用前微熱，使其完全溶解 。 （ 13）記下紫紅色斑點(diǎn)與所 劃線的距離記做 X， 層析液前沿 與所 劃線的距離記做 Y。 將 薄層板 放在干凈、通風(fēng)的水平工作臺(tái)上 30min,讓其自然干燥。 用毛細(xì)滴管吸取 配制樣品溶液 ，輕輕劃在起始線上， 待干后再劃一道，如此重復(fù) 10～ 20 次即可，劃線不可太粗，控制在 2mm 左右。 （ 6）從冰箱中取得制備的蛋白質(zhì)沉淀，化凍，溶解。 （ 4）將干燥的薄層層析板放入烘箱內(nèi) l10℃活化 15min 置于干燥器中保存?zhèn)溆?。 淮海工學(xué)院二○○六屆畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 第 7 頁(yè) 共 16 頁(yè) 表 4 鹽藻胞外蛋白質(zhì)的含量測(cè)定 的溶液配制 管號(hào) 對(duì)照 1 2 3 蒸餾水 (ml) 0 0 0 蛋白溶液 (ml) 0 染色液 (ml) 3 3 3 3 鹽藻胞外蛋白質(zhì)的 薄板層析與 Rf 值的測(cè)定 （ 1）用洗衣粉清洗玻璃板 4 12cm 和 15 cm 各兩塊，然后用蒸餾水沖洗，晾干待用。從冰箱中取出預(yù)冷 24h 的丙酮，按與鹽藻上清液 1： 1 的體積緩慢加入 500mL 到燒杯中，并不斷用玻璃棒攪拌。 (4) 將離心取得胞外蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán) G250 定量測(cè)蛋白質(zhì)法 [7]。培養(yǎng) 15d 后，進(jìn)行 胞外蛋白質(zhì)提取。并繪制 標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線 如圖 1 淮海工學(xué)院二○○六屆畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 第 6 頁(yè) 共 16 頁(yè) 表 3標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制 管號(hào) 對(duì)照 1 2 3 4 5 (ml) 0 蒸餾水 (ml) 0 加入的標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度 (mg/ml) 0 染色液 (ml) 3 3 3 3 3 3 A595nm 0 標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線 y = 4 . 7 2 1 4 x0 . 00 . 20 . 40 . 60 . 81 . 00 . 0 0 0 . 0 5 0 . 1 0 0 . 1 5 0 . 2 0 0 . 2 5蛋白質(zhì)濃度 / m g / m LA595 圖 1 標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白的吸光度與蛋白質(zhì)濃度曲線 鹽藻胞外蛋白質(zhì)的獲取與含量測(cè)定 (1)鹽藻生長(zhǎng)培養(yǎng)在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行。 淮海工學(xué)院二○○六屆畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 第 4 頁(yè) 共 16 頁(yè) 表 2 鹽藻的氨基酸含量 氨基酸 干藻團(tuán)（ 40%蛋白質(zhì)） g/100g蛋白質(zhì) 去甘油和β胡蘿卜素后的干物 質(zhì)（ 70%蛋白質(zhì)） g/100g 丙氨酸 精氨酸 天門(mén)冬氨酸 半胱氨酸 谷氨酸 甘氨酸 組氨酸 異亮氨酸 亮氨酸 懶氨酸 蛋氨酸 苯丙氨酸 絲 氨酸 蘇氨酸 色氨酸 纈氨酸 脯氨酸 酪 氨 酸 2 材料與方法 實(shí)驗(yàn) 材料 實(shí)驗(yàn) 原 材料 鹽藻 (DunalieUa Salina)由中國(guó)海洋大學(xué)提供，實(shí)驗(yàn)前培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期備用。應(yīng)用酶解 工 藝是今后發(fā)展海藻飼料業(yè)的一種很有希望的加工工藝，還有待于繼續(xù)深入研究，開(kāi)發(fā)更好的提取方法。 本試驗(yàn)研究意義及前景 我國(guó)海藻資源豐富，其中有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的海藻就有 100多種，是一種開(kāi)發(fā)利用前景廣闊的海洋資源。蛋白質(zhì)含量高達(dá) 50％左右 (干粉 )，相當(dāng)于全脂奶粉的 2 倍 [3]。杜氏藻蛋白質(zhì)的氨基酸組分見(jiàn)表 2[3]。由于魚(yú)和海鮮的消費(fèi)量越來(lái)越大 ， 微藻在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的利用具有新的潛力。關(guān)于微藻對(duì)人類營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的研究所得的最后結(jié)論是 :用微藻作為食物是可行的。介質(zhì)中的營(yíng)養(yǎng)鹽與β — 胡蘿卜素的合成也有關(guān)系。而脫落酸含量增長(zhǎng)的早期又會(huì)促進(jìn)β — 胡蘿卜素的合成。決定形成的雙鍵是 Z 型還是 E 型， 從而決定以后 — 異構(gòu)體的構(gòu)型。分析其生物合成過(guò)程，推斷異構(gòu)化過(guò)程受到異戊烯焦磷酸 轉(zhuǎn)移酶的控制。有關(guān)β — 胡蘿卜素的累積機(jī)制，特別是異構(gòu)化位置的研究，倍受關(guān)注。而且 人工合成的β — 胡蘿卜素中，β — 胡蘿卜素順式異構(gòu)體的含量少，只占 20%左右。 鹽藻的 研究現(xiàn)狀 隨著人們對(duì)β — 胡 蘿卜素功效的認(rèn)識(shí)日益深入，對(duì)有關(guān)鹽藻累積β — 胡蘿卜素的研究也逐步加深。如果綜合利用，鹽生杜氏藻細(xì)胞成分的 60%~70%可轉(zhuǎn)變?yōu)橛杏玫漠a(chǎn)品 。杜氏藻的自然群體有明顯的季節(jié)變化，在 夏季時(shí) 當(dāng)水溫超過(guò) 30℃ 時(shí)，自然群體最為豐富，但它們?cè)谒胁⒉皇蔷鶆蚍植嫉?，通? 和 D. parva 集中于水體表層，而綠色杜氏藻 (D. viridis)常在水體的下層和底泥表面。細(xì)胞內(nèi)鈉和鉀濃度與鹽濃度變化是無(wú)關(guān)的?？梢?jiàn)杜氏藻耐受鹽濃度變化范圍很寬。接合子為綠色或紅色，外面有一層厚而平滑的壁，經(jīng)過(guò)休止階段后，接合子核分裂生成 32 個(gè)細(xì)胞，通過(guò)母細(xì)胞壁放出 [2]。在不同條件下，