【導讀】§3亞慢性和慢性毒性作用。急性毒性是指機體(人或試驗。②并通過觀察動物中毒表現和死亡的情況，了解急性毒作。中毒資料、初步評價對人體產生損害的危險性。⑤研究化學毒物急性中毒的預防和急救治療措施。⑥為毒理學機制研究提供線索。劑量—反應曲線斜率。④價格較低和易于飼養(yǎng)等條件。1．試驗動物的種屬和品系。急性皮膚毒性試驗可選用成年大鼠、豚鼠或家兔，優(yōu)先考慮白色家兔。急性試驗動物不宜過老或過幼，通常要求選擇剛成年。動物進行試驗，而且須是未曾交配和受孕的動物。變異范圍不應超過該批動物平均體重的20％。急性毒性試驗的主要內容是求LD50，除特殊要求。別求出雌性與雄性動物各自的LD50。大、小鼠等小動物每組10只。狗等大動物每組6只。經消化道染毒時，要求試驗前對動物禁食。①設定以此預期值作為待測化學物的中間劑量組，并。一般來說、根據試驗設計所選用的LD50計算方法來確定。例如幾率單位法、寇氏法一般設6～10個劑量組；數即得出各組劑量的真實值。

　　

【正文】 的試驗。 其主要可檢出 DNA斷裂劑和非整倍體誘變劑。 觀察化學毒物致突變作用的基本方法 9/15/2020 76 觀察化學毒物致突變作用的基本方法 (二 )微核試驗 9/15/2020 77 MN NCE 觀察化學毒物致突變作用的基本方法 9/15/2020 78 ? 二、常用的致突變試驗 ? (三 )染色體畸變分析 ? (四 )姐妹染色單體交換試驗（ SCE） 觀察化學毒物致突變作用的基本方法 9/15/2020 79 ? 二、常用的致突變試驗 ? (五 )果蠅伴性隱性致死試驗 ? (六 )顯性致死試驗 ? (七 )程序外 DNA臺成試驗 ? (八 )轉基因動物致突變試驗 ? (九 )哺乳動物細胞基因突變試驗 觀察化學毒物致突變作用的基本方法 9/15/2020 80 ? 三、致突變試驗中的一些問題 ? (一 )陰性和陽性對照的設立 ? 1．陰性對照 它是空白對照，即不加任何處理?；蛘呤侨軇φ?。陰性對照除了無處理因素外，與實驗組完全相同。其目的是獲得實驗的基礎數據。例如， Ames試驗的陰性對照可了解所用的細菌的自發(fā)回復突變率；證實除處理因素外無任何使回復突變率增加或減少的因素。 ? 2．陽性對照 是用某種已知能產生陽性反應的物質作為對照。其目的是通過對陽性物質的試驗證明實驗方法的可靠；驗證實驗者在本實驗條件下，完成技術和鑒定致突變物的能力；證實經一段時間后，本實驗的重復性。例如，Ames試驗中陽性對照未出現陽性結果，應考慮突變菌株可能發(fā)生問題，另一種可能是代謝活化能力不足。所以，當陽性對照結果未呈陽性，其實驗組的實驗數據可靠性亦大大降低。 觀察化學毒物致突變作用的基本方法 9/15/2020 81 ? 三、致突變試驗中的一些問題 ? (二 )體外試驗的活化系統(tǒng) ? 1．哺乳動物細胞介導 使用完整的細胞，特別是大鼠肝原代細胞，與測試細菌或細胞一起培養(yǎng)。這也是一種活化系統(tǒng)。它有完整的細胞結構和各種酶及內源性輔助因子，代謝能力優(yōu)于無細胞系統(tǒng)如 S9，但不如體內活化系統(tǒng)。 ? 2． S9 S9指經酶誘導劑處理后制備的肝勻漿，再經 9000g離心分離所得上清液，加上適當的緩沖液和輔助因子。它主要含有混合功能氧化酶 (MFO)，是國內常規(guī)應用于體外致突變試驗的代謝活化系統(tǒng)，其缺點是 S9隨實驗動物種屬或器官不同而有差異；S9含有的大量親核物質有可能影響試驗的敏感性。 ? 3．純化酶和基因工程 應用純化細胞色素 P450、谷胱苷肽轉移酶及過氧化物水解酶，可嚴格控制代謝產物誘發(fā)突變的條件，但技術難度大。利用基因工程，將人的細胞色素 P450基因，插入組合細胞內，用上述細胞進行致突變試驗，使細胞具有代謝活化系統(tǒng)。 觀察化學毒物致突變作用的基本方法 9/15/2020 82 ? 三、致突變試驗中的一些問題 ? (三 )致突變試驗與致癌試驗的關系 ? ①已知大多數化學致癌物具有致突變作用，遺傳學改變在原癌基因激活和抑癌基因失活上起主要作用，致癌物誘致關鍵靶基因遺傳改變的直接作用等在哺乳動物實驗中證實。 ? ②發(fā)現人類接觸致癌物與 DNA加合物，同其腫瘤中癌基因和抑癌基因的特異堿基對突變之間具有相關性。 ? ③傳統(tǒng)的長期致癌試驗，花費大，周期長，不能適應化學物質快速增長的需要。此外，致癌試驗所用動物數量有限，難以檢出弱的致癌物。需要發(fā)展多種體內和體外短期試驗，用于對化學物質致癌性進行篩檢。 觀察化學毒物致突變作用的基本方法 9/15/2020 83 ? 三、致突變試驗中的一些問題 ? (四 )試驗結果在毒理學安全性評價中的作用 ? 陰性結果判定條件： ? ①最高劑量應包括受試物溶解度許可或灌胃量許可的最大劑量。如該劑量毒性很大，則體內試驗和細菌試驗應為最大耐受量。使用哺乳動物細胞進行體外試驗，常選 LD50或 LD80為最大劑量。溶解度大、毒性低的化學物，在細菌試驗中可以 5000μ g／皿作為最高劑量。 ? ②各劑量組的組間差距不應過大，以防漏檢僅在非常狹窄范圍內才有突變能力的某些化學毒物。滿足上述條件，仍為陰性，才慎重下結論。 觀察化學毒物致突變作用的基本方法 9/15/2020 84 ? 三、致突變試驗中的一些問題 ? (四 )試驗結果在毒理學安全性評價中的作用 ?陽性結果應具有劑量 — 反應關系，即隨劑量增加，致突變作用增加；和在一組或多組的觀察值與陰性對照比較有顯著性差異。陽性結論，即表明受試物具有致突變性，而不同致突變試驗的遺傳學終點不同，其所表示的含義不一。如基因突變是具有導致遺傳性疾病的突變， DNA修復的實際后果尚不明確。 觀察化學毒物致突變作用的基本方法 9/15/2020 85 致突變試驗舉例 ? 美國 EPA毒物處 (1936)提出了一個三階段的試驗方案，把遺傳毒性檢測和生殖細胞致突變性驗證分階段進行。 ? 第一階段測試化學物的遺傳毒性，包括 Ames試驗、體外哺乳動物細胞基因突變試驗、體內骨髓染色體損傷試驗 (微核試驗或染色體畸變試驗 )； ? 第二階段測試對生殖細胞的致突變作用； ? 第三階段為哺乳動物生殖細胞致突變性標準試驗。 ? 在遺傳危害性評價時，在體外基因突變試驗中呈陽性的化學物應進行與哺乳類性腺DNA相互作用的試驗，包括睪丸細胞的 SCE、 UDS、染色體畸變及堿性洗脫試驗等，也可進行顯性致死試驗，在第二階段中出現陽性反應，需進行小鼠特異座位試驗，可觀察形態(tài)改變或生化改變；在體內骨髓細胞染色體畸變試驗或微核試驗中呈陽性的化學物需進行顯性致死試驗，在第二階段中出現陽性反應，再進行小鼠可遺傳易位試驗。 9/15/2020 86 致突變試驗舉例 ? 國際協調組織 (1CH)(1997)對于藥品的遺傳毒性評價建議的檢測試驗組合為 ? ①細菌基因突變試驗； ? ②體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗或體外小鼠淋巴瘤細胞比試驗； ? ③體內嚙齒類造血細胞染色體損傷試驗 (骨髓細胞染色體畸變試驗或骨髓或外周血多染紅細胞微核試驗 )。 ? 在對經標準試驗組合得到的致突變作用結果進行進一步研究時，其他試驗如DNA加合物測定、 DNA鏈斷裂檢測、 DNA修復和重組試驗等都可作為供選擇的試驗。對于在三項標準試驗中為陰性的化學物，通?？烧J為其無遺傳毒性作用。但對于構效關系顯示有可能具致癌性或致突變性，但在三項標準試驗中為陰性的化學物，還需要改進試驗方法或再增加試驗項目。對于在三項標準試驗中為陰性，但致癌試驗顯示有致癌效應，又無明確的證據說明該化學物是通過非遺傳毒性機制發(fā)揮作用時，為了了解其作用方式，可再進行改變代謝活化系統(tǒng)的體外試驗或應用腫瘤發(fā)生的靶器官進行遺傳損傷試驗 (如肝臟 UDS試驗、 DNA加合物檢測、轉基因突變檢測、腫瘤相關基因的遺傳改變檢測 )。 9/15/2020 87 致突變試驗舉例 ? 我國衛(wèi)生部在 《 食品安全性毒理學評價程序 》(1994)中對遺傳毒理學試驗的要求是： ? 根據受試物的化學結構、理化性質以及對遺傳物質作用終點的不同，并兼顧體外和體內試驗 以及體細胞和生殖細胞的原則，在 Ames路試驗、小鼠骨髓微核試驗或骨髓細胞染色體畸變試驗、小鼠精子畸形試驗和睪丸染色體畸變試驗中選擇四項，如其中一項試驗為陽性，還應在其他備選試驗 (V79細胞 HGPRT基因突變試驗，顯性致死試驗，果蠅伴性隱性致死試驗， UDS試驗 )中再選擇兩項試驗進行。我國《 農藥安全性毒理學評價程序 》 (1991)中對遺傳毒理學試驗的要求則為： Ames試驗和大腸桿菌回復突變試驗，骨髓細胞微核試驗或骨髓細胞染色體畸變試驗，睪丸細胞染色體畸變試驗或顯性致死試驗為必做項目，若有一項出現陽性，還需從精子畸形試驗、體外培養(yǎng)細胞染色體畸變試驗、 UDS、果蠅伴性隱性致死試驗等試驗中再選擇兩項進行。