【導讀】第五節(jié)觀察化學毒物致突變作用。是毒理學的一個分支，研究外源化學物。害作用及其規(guī)律。其主要目的是檢測那。遺傳毒作用的特點及對人類的潛在危害。變實際上是遺傳物質的一種可遺傳的變異。轉錄、修復時的堿基配對錯誤所產生的突變。誘變劑誘發(fā)的突變。同細胞分裂過程而傳遞。簡單地說，突變的發(fā)生及。體細胞和生殖細胞(germ. 細胞周期、有絲分裂。指某一堿基配對性能改變或脫落所致的突變。1．非整倍體非整倍體指細胞丟失或。缺失一條染色體時稱為單。染色體數目的改變會導致基因平衡的。如21三體導致先天愚型。2．整倍體整倍體指染色體數目的異常。為69條染色體，4n為92條染色體。類自然流產的胎兒細胞中可有三倍體細胞的存在。發(fā)生于生殖細胞的整倍體改變，幾乎都是致死性的。DNA損傷，誘發(fā)基因突變或染色體畸變。

　　

【正文】 點，嚙齒動物血漿AUC(時量曲線下面積 )為人的 25倍；③選擇吸收飽和劑量 。④ 藥效學終點，不應產生生理學和內穩(wěn)態(tài)紊亂 。⑤ 最大可行劑量，受試物在飼料中最高含量為 5％。限制劑量為1500mg／ (kg體重 d)。 第三節(jié) 觀察化學毒物致癌作用的基本方法 62 ? （二）劑量選擇和動物數量 ? 中及低劑量組則按等比級數下推，如分別為上一個劑量水平的 1/2或 1/3。低劑量組應不影響動物的正常生長、發(fā)育和壽命，即不產生任何毒性效應。但低劑量組應高于人的接觸劑量，一般不低于高劑量的 10％。中劑量組介于高、低劑量之間，如有可能按受試物的毒物動力學性質來確定。對照組除不給受試物外，其他條件均與試驗組相同。 ? 同時應設陰性 (溶劑或賦形劑 )對照組。必要時可設陽性對照組，陽性致癌物最好與受試物的化學結構相近。 ? 動物數量： 每組至少有雌雄各 50只動物，希望在出現第一個腫瘤時，每組還有不少于 25只動物。 第三節(jié) 觀察化學毒物致癌作用的基本方法 63 第三節(jié) 觀察化學毒物致癌作用的基本方法 64 ? （三）染毒途徑 ? 經口染毒是將受試物給予實驗動物的常用途徑，一般把受試物摻人飼料或飲水中連續(xù)給予動物 (5～ 7天 /周 )。若摻入后的適口性不良，可用灌胃法。摻入濃度要定期監(jiān)測，觀察其均勻性和穩(wěn)定性，摻入的濃度一般不超過 5％。 ? 經皮染毒，涂敷受試物的面積一般不少于動物體表總面積的 10％。必須保證受試物與皮膚良好接觸，并防止動物舔食。每天涂抹一次，每周 3～ 7次。 ? 吸入染毒，每天染毒 4小時，每周 5～ 7天。染毒柜內受試物濃度應定期或連續(xù)監(jiān)測，其分布應均勻、恒定。 ? 其他注射途徑可根據需要采用。 第三節(jié) 觀察化學毒物致癌作用的基本方法 65 ? （四）試驗期限 ? ICH(1997)建議參考下面幾條準則： ? (1)一般情況下，試驗期限小鼠和倉鼠應為 18個月，大鼠為 24個月；然而對于某些生命期較長或自發(fā)腫瘤率低的動物品系，小鼠和倉鼠可持續(xù) 24個月，大鼠可持續(xù) 30個月。 ? (2)當最低劑量組或對照組存活的動物只有 25％時，也可以結束試驗，對于有明顯性別差異的試驗，則試驗結束的時間對不同的性別應有所不同，在某種情況下因明顯的毒性作用，只造成高劑量組動物過早死亡，此時不應結束試驗。 ? 一個合格的陰性對照試驗應符合下列標準： ? ①因自溶、同類自食，或因管理問題所造成的動物損失在任何一組都不能高于 10％。 ? ②小鼠和倉鼠在 18個月，大鼠在 24個月時各組存活的動物不能少于 50％。 第三節(jié) 觀察化學毒物致癌作用的基本方法 66 ? （五）觀察和結果分析 ? 1．一般觀察 每天觀察受試動物一次，主要觀察其外表、活動、攝食情況等。在實驗最初三個月每周稱體重一次，以后每兩周稱體重一次。經飼料或飲水給以受試物時，應記錄食物消耗量或飲水量，以計算受試物的攝入量。觀察時要注意有無腫瘤出現、腫瘤出現時間及死亡時間。老年動物多病易死，應加強巡視，防止動物死亡后未及時刻驗，發(fā)生尸體組織自溶。 ? 2．病理檢查 動物自然死亡或處死后必須及時進行病理檢查，包括肉眼和組織切片檢查。組織切片檢查應包括已出現腫瘤或可疑腫瘤的器官和肉眼檢查有明顯病變的器官，應注意觀察癌前病變。通過病理檢查確定腫瘤的性質和靶器官。 第三節(jié) 觀察化學毒物致癌作用的基本方法 67 ? （五）觀察和結果分析 ? 3．結果分析 統(tǒng)計各種腫瘤的數量 (包括良性和惡性腫瘤 )及任何少見的腫瘤、患腫瘤的動物數、每只動物的腫瘤數及腫瘤潛伏期。 腫瘤發(fā)生率 (％ )＝ (實驗結束時患腫瘤動物總數 /有效動物總數 ) 100％ ? 式中，有效動物總數指最早發(fā)現腫瘤時存活動物總數。腫瘤潛伏期即從攝入受試物起到發(fā)現腫瘤的時間，因為內臟腫瘤不易覺察，通常將腫瘤引起該動物死亡的時間定為發(fā)生腫瘤的時間。應對試驗結果進行仔細的統(tǒng)計學分析，并研究劑量 — 反應關系。 第三節(jié) 觀察化學毒物致癌作用的基本方法 68 ? 致癌試驗陽性的判定標準 [WHO(1969)]： ? (1)對于對照組也出現的一種或數種腫瘤，試驗組腫瘤發(fā)生率增加； ? (2)試驗組發(fā)生對照組沒有的腫瘤類型； ? (3)試驗組腫瘤發(fā)生早于對照組； ? (4)與對照組比較，試驗組每個動物的平均腫瘤數增加。 ? 在進行試驗的兩個物種兩種性別動物中，有一種結果為陽性，即認為該受試物有致癌性。兩個物種兩種性別動物試驗結果均為陰性時，方能認為未觀察到致癌作用。 第三節(jié) 觀察化學毒物致癌作用的基本方法 69 第三節(jié) 觀察化學毒物致癌作用的基本方法 ? 結果報告： ? 應著重報告發(fā)現腫瘤的部位、數量、性質、癌前病變，以及其他毒性效應； ? 應報告劑量 — 反應關系及統(tǒng)計學分析結果。 ? 如在動物組織中觀察到良性和惡性腫瘤，并有良性腫瘤向惡性化進展的證據，在進行統(tǒng)計學分析之前將良性和惡性腫瘤合并是適宜的，但仍希望分別對良性和惡性腫瘤分別進行統(tǒng)計學處理。 ? 評價該試驗不同劑量良性腫瘤和惡性腫瘤的相對數量可有助于確定該受試動物對受試物的劑量反應關系。另一方面，如果僅觀察到良性腫瘤，并無惡性化進展的證據，則將此受試物認為是致癌物是不適宜的，此僅提示在該試驗條件下需要進一步研究。 70 ? 三、人群流行病學觀察： ? （一）接觸標記 ? （二）生物效應標記 ? （三）敏感性標記 第三節(jié) 觀察化學毒物致癌作用的基本方法 71 第三節(jié) 觀察化學毒物致癌作用的基本方法 ? 四、轉基因小鼠在致癌作用的研究 ? 1．轉癌基因小鼠。 與轉錄啟動子連接的癌基因轉入后可直接在某些特定的組織中高效表達，使該組織細胞處于引發(fā)狀態(tài)，這類轉基因動物是研究化學物致癌作用的敏感體系。攜帶癌基因的轉基因動物可用于致癌試驗，試驗周期僅 3個月左右，有希望發(fā)展成代替長期動物致癌試驗的試驗系統(tǒng)。這些攜帶有癌基因的轉基因動物，可用來研究外源化學物與腫瘤相關基因的作用及外源化學物在致癌不同階段中的作用機制。以各種組織特異性的促長劑處理轉入不同癌基因的小鼠，可為致癌過程的研究提供新線索。 72 ? 四、轉基因小鼠在致癌作用的研究： ? 2．腫瘤抑制基因敲除小鼠。 在 P53/小鼠，腫瘤 (特別是淋巴肉瘤 )的發(fā)生比正常小鼠 (P53+/+)增加而且提前。由于 P53/小鼠的腫瘤發(fā)生具有組織特異性，進一步研究這些腫瘤的遺傳學基礎有助于鑒定 P53基因的功能。而半合子小鼠 (P53+/)在出生后 6個月內自發(fā)癌發(fā)生率低，但在之后發(fā)生淋巴瘤和軟組織肉瘤，其中大部分丟失 P53野生型等位基因。這種小鼠對遺傳毒性致癌物敏感性并不增加。這種半合子小鼠也可用于鑒定致癌過程中的協(xié)作基因。而且缺 P53小鼠加速形成惡性腫瘤，提示此基因主要在進展階段起作用。 P53在腫瘤發(fā)生中的作用有待進一步研究。 第三節(jié) 觀察化學毒物致癌作用的基本方法 73 ?四、轉基因小鼠在致癌作用的研究： ? 3．轉穿梭質粒的轉基因動物小鼠 ：轉入帶有報告基因的穿梭載體，是研究體內基因突變的轉基因動物模型。常用的靶基因如 lacI、 lacZ可通過噬菌體體外包裝等方法，從小鼠基因組內回收，再在大腸桿菌內檢測靶基因突變，可為研究不同器官基因的自發(fā)突變和誘發(fā)突變的分子機制提供有效的方法 。 第三節(jié) 觀察化學毒物致癌作用的基本方法