【導(dǎo)讀】（抗生素、乙醇、檸檬酸占。要求下游加工有一定彈性。從工業(yè)發(fā)酵范疇來看，從發(fā)酵液中獲得。影響提煉方法的因素。分離菌體胞內(nèi)酶與代謝產(chǎn)物的方法明顯不同；如何著手對一種未知的發(fā)酵產(chǎn)品進行提取。–①可大致確定它是屬于哪一類型；–②可了解它是一種成分還是幾種成分的混合物。即確定提取條件。除了上述幾種外，還含濃縮、結(jié)晶、干燥、蒸餾等。防醪中所需產(chǎn)物被分解或揮發(fā)；含有無機鹽類、非蛋白質(zhì)大分子雜質(zhì)及。通過過濾處理，將固形雜質(zhì)去除。,采用高速離心。中心進料，因固液比重不同，在碟片空間內(nèi)。由于離心力的作用，把醪分成固液兩相。下部進料，經(jīng)檔板分散于轉(zhuǎn)筒底部，受離心。菌體位于轉(zhuǎn)筒壁，停機的時。加熱使蛋白質(zhì)凝固，添加能相互反應(yīng)、或能和某些溶解鹽類。提高過濾速濾有幫助。

　　

【正文】 孔越大，吸水膨脹就越大 。 2020422 交聯(lián)葡聚糖凝膠的化學(xué)結(jié)構(gòu) 2020422 G類葡聚糖凝膠常用 GX代表， X數(shù)字既代表交聯(lián)度，也代表特水量： ?X數(shù)字越小，交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔越小，適用于分離低分子質(zhì)量生化產(chǎn)品。 ?X數(shù)字越大，交聯(lián)度越小，網(wǎng)孔越大，適用于分離高分子生化產(chǎn)品 ?X數(shù)字也代表凝膠的持水量，如 G25表示 1g干膠持水 ， G100表示 1g干膠持水 10mL，依次類推 2020422 四、凝膠層析的基本操作 1．層析柱的選擇 層析柱大小主要是根據(jù)樣品量的多少以及對分辨率的要求來進行選擇。一般來講，主要是層析柱的長度對分辨率影響較大，長的層析柱分辨率要比短的高；但層析柱過長會引起柱子不均一、流速過慢等困難。一般柱長度不超過 100 cm，可以將柱子串聯(lián)使用。層析柱的直徑和長度比一般在 1： 25～ 1：100之間。 2020422 層析柱 （ a） 自制簡易層祈柱 （ 1． 玻璃管； ； 3． 尼龍網(wǎng) ） ； （ b） 普通商品柱； （ c） 雙底板層析柱 （ 脫液進出口； ； 3． 柱床； 4． 恒溫水進口；5． 恒溫水出口； 6． 可調(diào)節(jié)的塞子 ） 2020422 2 凝膠的選擇與處理 ? 孔徑 r正比與凝膠聚合物分子直徑 d，反比于凝膠濃度平方根。 ? 選擇適宜的凝膠是取得良好分離效果的最根本的保證。選取何種凝膠及其型號、粒度，一方面要考慮凝膠的性質(zhì)，包括凝膠的分離范圍（滲入限與排阻限）還有它的理化穩(wěn)定性、強度、非特異吸附性質(zhì)等；另一方面還要注意到分離目的和樣品的性質(zhì)。 2020422 ? 細粒凝膠柱流速低，但洗脫峰窄，分辨率高，多用于精制分離或分析等。 ? 粗粒凝膠柱流速高，但洗脫峰平坦，分辨率低，多用于粗制分離，脫鹽等。 在同一流速下不同粒度的 Sephadex G25柱的洗脫效果。 2020422 不同分離范圍的葡聚糖凝膠上 ， 血清蛋白的層析圖 2020422 ? 一般柱層析中 ， 使用干顆粒直徑在 70μm 左右較合適 。 對于在水中保存的凝膠如瓊脂粉凝膠顆粒直徑應(yīng)在 150μm 左右 。 ? 凝膠顆粒大小要均勻 ， 這樣流速穩(wěn)定 ， 效果較好 。 ? 干粉形式保存使用前用水或洗脫緩沖液充分溶脹：將干膠往水里加 ， 邊加邊攪 ， 以防凝膠結(jié)塊 ， 然后放到沸水浴中加熱接近 100℃ ， 幾個小時就可以使其溶脹 ， 還可起到除去顆粒內(nèi)部氣泡和殺菌作用 。 2020422 3 裝柱 ?緩慢加入 ， 自然沉積 ， 逐層水平上升 ， 可得均勻柱 。 ? 柱裝得不好往往造成洗脫區(qū)帶加寬 ， 甚至使一些本來可以分開的區(qū)帶重疊 。 ? 裝柱時操作壓力太大 ， 會使凝膠床壓得太實 ， 從而降低流速 。 2020422 ?新柱裝好后，要用洗脫緩沖液平衡，一般用 3～ 5倍體積的緩沖液在恒壓下流過柱床。 ?檢驗均勻性：可用帶色的高分子物質(zhì)如藍色葡聚糖 2020配成 2mg/mL的溶液過柱，觀察色帶是否均勻下降。也可以對光檢查，看其是否均勻或有無氣泡存在。 2020422 4 加樣 ? 要求樣品粘度小于 s（ 帕斯卡秒 ） ? 對蛋白質(zhì)類樣品濃度以不大于 4％ 為宜 ? 如果樣品渾濁 ， 應(yīng)先過濾或離心除去顆粒后上柱 ? 分析用量一般為每 100mL床體積加樣品 1～ 2mL ? 制備用量一般為每 100 mL床體積加樣品 20～ 30 mL 2020422 （ 1）加葡萄糖 2020，使終濃度為 5%，相對粘度 。 （ 2）加葡萄糖 2020，使終濃度為 %，相對粘度 。 （ 3）加葡萄糖 2020，使終濃度為 1%. 2020422 ? 樣品與柱床體積比例懸殊時分離效果好，但過少的樣品量不但會造成設(shè)備和器材的浪費，降低工作效率，還會造成樣品稀釋。 ?加樣時應(yīng)盡量減少樣品的稀釋及凝膠床面的攪動。否則將造成色譜帶擴散、紊亂，嚴(yán)重影響分離效果。 2020422 5 洗脫 ? 保持一定的操作壓、流速、冼脫液成分，以防凝膠顆粒的漲縮引起柱床體積變化或流速改變。 ? 洗脫液：主要取決于待分離樣品，一般來說只要能溶解被洗脫物質(zhì)并不使其變性的緩沖液都可以用于凝膠層析。為了防止凝膠可能有吸附作用，一般也采用緩沖鹽。 2020422 操作注意 : ? (1)凝膠的選擇要恰當(dāng) (據(jù)發(fā)酵醪、產(chǎn)物性質(zhì)而定 )。 ? (2)須膨脹后使用。 ? (3)裝柱后要洗滌。 ? (4)要反沖除雜質(zhì)。 ? (5)保存須防腐。 2020422 五 .影響凝膠層析的因素 : 1. 種類 (選擇 ) ? 應(yīng)視處理液和洗脫液的性質(zhì)而定。 2. 粒度 ? 粒度的大小影響顆粒間間隙的大小，從而影響分離效果。 2020422 ? 恒定、合適 ? 流速的快慢 ,會導(dǎo)致色層譜變形，影響分離效果。 ? 保持洗脫速度恒定通常有兩種方法，一種是使用恒流泵，另一種是恒壓重力洗脫。 4. 離子強度和 pH值 ? 非水溶性物質(zhì) →→ 有機劑洗脫； ? 水溶性物質(zhì) →→ 水或緩沖洗脫液 (具有不同離子強度和pH值 )洗脫。 2020422 較快的流速下得到的冼脫峰寬 。 流速低洗脫峰窄而高 。 也就是說 ， 流速較低 ， 分辨率較高 ， 樣品稀釋較輕 。 2020422 ? 體積比濃度的影響更大 , 510%。 、直徑 ? 柱長 :直徑 =10:1或 7:1 V0 ? 對于裝填良好的柱 V0/Vi=4060% 2020422 六 .防止微生物污染的方法 防止污染的辦法： ? 加抑菌劑 ? 加防腐劑 工業(yè)用防腐劑要求： – ①不與凝膠發(fā)生作用。 – ②不會引起溶質(zhì)變化。 – ③不會使凝膠色澤變化。 2020422 七．凝膠的再生 : ? 方法：視污染程度不同而不同 (1)局部增補凝膠 (局部 )。 (2)酸、堿再生 (輕度 )。 (3)綜合再生 (嚴(yán)重 )。 2020422 ? 現(xiàn)象 : 多次使用，凝膠顆粒可能逐漸沉積壓緊，流速變慢 ?處理方法： 將凝膠自柱內(nèi)倒出重新填裝 反沖法，使凝膠松散沖起，然后自然沉降，形成新的柱床 2020422 凝膠用過后，有幾種保存方法： ?濕態(tài)保存：在水相中加防腐劑，或水洗到中性，高壓滅菌封存（或低溫存放）； ?半收縮保存：水洗濾干，加 70％乙醇使膠收縮，再浸泡于70％乙醇中保存； ?干燥保存：水洗濾干，依次用 50％、 70％、 90％、 95％乙醇脫水，再用乙醚洗去乙醇，干燥 (或 60～ 80℃ 烘干）后保存。 2020422 八、凝膠層析在工業(yè)發(fā)酵中的應(yīng)用 ?脫鹽 ?去除熱源物質(zhì) ?濃縮 ?分析 ?分子量測定 ?純化青霉素等。 2020422 G－ 25分離氨基酸混合物圖 2020422 九 .凝膠層析常見問題 1．流速慢 （ 1）有氣泡、出水管阻塞 （ 2）沒打開夾子 （ 3）柱壓太緊（操作壓過大、長期使用、接頭漏氣） 2020422 2．柱內(nèi)產(chǎn)生氣泡 （ 1）上水口不流或皮管破裂，洗脫液外流 （ 2）接口漏氣，如上水口螺絲擰的不緊 3．條帶扭曲 （ 1）膠面不平 （ 2）樣品或洗脫液中有顆粒 （ 3）裝柱不均勻 2020422 4．分辯率不高 （ 1）裝柱不均勻 （ 2）樣品量過大 （ 3）流速太快 （ 4）柱不垂直或不合適 （ 5）長菌 （ 6）拄下口軟管太長 （ 7）膠不適當(dāng) 2020422 6 濃縮 ? 去除溶劑，將低濃度 →→ 高濃度。 ? 據(jù)去除溶劑方式，而分為：蒸發(fā)、冰凍、吸收、超濃縮。 ? 用于：有機酸、氨基酸、核苷酸、酶制劑等的發(fā)酵液及提取液 2020422 一、蒸發(fā)濃縮 ? 將溶液加熱到沸騰，溶劑蒸發(fā)，溶質(zhì)留下 機理： ? 某一溫度下，溶液具有一定的飽和蒸汽壓，當(dāng)液面溶劑蒸汽分子密度很小時，溶劑分子就會不斷地汽化逸出空間，以維持這一飽和蒸汽壓。 ? 分子受熱動能增加。受熱越多，獲得的動能也越大，分子逃離的可能性越大。低溫時，分子的動能小，運動速度慢，不能遠離汽相和液相的空間，蒸發(fā)速度很慢。 2020422 影響蒸發(fā)濃縮的因素 ? 溫度：高，動能大； ? 面積：大，汽化的分子數(shù)多、蒸速快； ? 溶劑蒸汽壓：越大，越慢； 2020422 蒸發(fā)濃縮的工業(yè)分類 常壓： 環(huán)管、橫管豎、夾套、外循環(huán)、強制循環(huán)、薄膜 真空： 單效、多效 2020422 蒸發(fā)濃縮過程的選擇和要求 （ 1）選擇 ? 蒸發(fā)方法因被蒸發(fā)溶液的性質(zhì) (① 熱敏性 。② 高粘度 。③ 易結(jié)垢或析出晶體 。④ 發(fā)泡 。⑤ 腐蝕性 )不同而不同 （ 2）要求 ? 傳熱強度大，汽液分離好，設(shè)備適應(yīng)物料性質(zhì)。 2020422 強制循環(huán)蒸發(fā)濃縮過程： ?料液流速大，傳熱系數(shù)高，適宜濃縮粘度大，易結(jié)晶結(jié)構(gòu)的物料； ?動力消耗大。 2020422 薄膜蒸發(fā)濃縮 ? 薄層流動，短時受熱，高效傳熱。 分為： ? 升膜式 ? 降膜式 ? 回轉(zhuǎn)式 ? 離心式 ? 板式 2020422 二、冰凍濃縮法 ? 在冰凍時，水分子結(jié)成冰。鹽類及發(fā)酵產(chǎn)品不進入冰內(nèi)而留在液相中。 2020422 三、吸收濃縮 ? 吸收劑直接吸收溶劑分子，使溶液濃縮。 ? 基本要求：吸收劑與溶液不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。 2020422 四、超濾濃縮法 ? 使用特殊的薄膜選擇性透過溶質(zhì)。 ? 常用作生物大分子的濃縮和脫鹽。 ? 超濾膜用惰性載體支撐。 2020422 7 沉淀法 一、沉淀法概述 : ? 利用物質(zhì)能和某些酸、堿或鹽形成不溶性或復(fù)合物沉淀或結(jié)晶。 ? 沉淀措施因產(chǎn)品性質(zhì)不同而不同。 ? 加酸、堿、鹽、有機溶劑、其它物質(zhì)。 2020422 ? 根據(jù)所加入沉淀劑的不同，沉淀法可分為： 鹽析 等電點 有機溶劑 非離子型聚合物 聚電解質(zhì) 高價金屬離子 2020422 二、等電點沉淀法 ? 利用兩性電解質(zhì)在等電點的溶解度最低和不同電解質(zhì)有不同等電點的特性，將兩性電解質(zhì)分離的方法。 ? 通過加酸或堿調(diào) pH＝ pI， pro分子的凈電荷為零，分子聚集在一起。 ? 注意：宜均勻。 2020422 三、 鹽析沉淀法 ： ? (1)鹽溶： [鹽 ]低時， S隨 [鹽 ]增加而增加； ? (2)鹽析： [鹽 ]高時， S隨 [鹽 ]增加而降低； 2020422 溶解度與鹽濃度的關(guān)系可用下式表示： logS=β － KSI ? S：蛋白質(zhì)的溶解度； ? I：離子強度； ? β ：常數(shù)，與蛋白質(zhì)種類有關(guān)，與鹽的種類無關(guān)； ? KS ：鹽析常數(shù)，與鹽種類有關(guān)，與溫度和 pH無關(guān) 。 2020422 ? 蛋白膠體穩(wěn)定的原因是蛋白質(zhì)顆粒周圍水化膜和電荷的存在。 加入鹽，中和表面電荷、破壞水化膜。 ? (1)鹽種類：影響 KS， KS越大，效果越好 ? (2)鹽析劑用量 ? (3) 溫度和 pH：影響 β 值而影響 S。尤其是影響相對溶解度 ? (4) 雜質(zhì) 2020422 4. 注意事項 ? ① [鹽 ] 因被提取物種類不同而不同； ? ② [鹽 ] 因被提取物的來源不同而不同； ? ③ 雜質(zhì) 對鹽析 有影響 ； ? ④鹽析時的 pH ≈ pI （？）； ? ⑤鹽析 產(chǎn)品 還 需進一步純化 （？）； 2020422 四、有機溶劑沉淀法 ? 利用某些物質(zhì)在有機溶劑中的溶解度不同而使其分離的方法。 ? ： ? 有機溶劑能 降低溶液的介電常數(shù) ，使溶質(zhì) 分子 間 因引力而凝集 ；或 破壞水膜 (降低水活度 )而溶解度降低；或 破壞 pro副鍵 ，改變其空間結(jié)構(gòu)而使疏水基團暴露而析出。 – 優(yōu)點：溶劑易除； – 缺點：易使蛋白質(zhì)變性； 2020422 : ? ① 溶劑的種類和數(shù)量：丙酮 乙醇 甲醇 ? ②沉淀的溫度：溫度越低沉淀越完全。 2020422 五、加熱沉淀法 依據(jù)：蛋白