【導(dǎo)讀】在廣大農(nóng)村，分散而且低密度的圈養(yǎng)條件下，動物的排泄物是一種非常好的有。飼養(yǎng)規(guī)模急劇增加，必然導(dǎo)致在較小的面積上產(chǎn)生出大料的排泄物。合理的分散和處理，便會對周圍的環(huán)境造成嚴重的污染。胃中缺乏植酸酶，對植物性飼料中的磷的利用率非常低，為滿足單胃動物對磷的需求量，目前，國內(nèi)外大量的實驗證明，在家。畜的飼料中添加植酸酶可以提高家畜對磷的利用率，從而可以減少向環(huán)境中排放的磷。在飼料中添加少量的植酸酶可以代替添加大量價格昂貴的無機。磷酸鈣，使飼料成本降低，而飼料的綜合利用率提高。植酸酶還能消除植酸對多種金屬。植酸酶因其多方面的應(yīng)用特點，植酸酶已成為飼料、醫(yī)學(xué)、人類營養(yǎng)、食品。③磷在機體內(nèi)參與碳水化合物的代謝和運輸，如在光合作用和呼吸作用的。生理過程中，糖的合成、轉(zhuǎn)化、降解大多數(shù)是在磷酸化以后才起反應(yīng)的。⑤磷還與脂肪轉(zhuǎn)化有關(guān)，脂肪代謝需要NADPH、ATP、CoA和NAD+. 68%-80%的磷在植物性飼料中都是以植酸的方式存在[1]。

　　

【正文】 12 小時酶活性增加非常緩慢，因為工程菌還未適應(yīng)甲醇環(huán)境，工程菌誘導(dǎo)后 12 小時后， 已適應(yīng)甲醇的環(huán)境，并開始產(chǎn)生植酸酶，酶活先快后慢，最終穩(wěn)定下來，活性不再增加。甲醇為唯一碳源誘導(dǎo)時，誘導(dǎo) 72 小時酶活性最大的，為 22367 U/mL。使用山梨醇 甲醇混合碳源時在 60h 活性最大，為25365U/mL。 因此，混合碳源的利用，不僅可以增加植酸酶的表達量，而且還縮短了誘導(dǎo)時間，因為甲醇是醇氧化酶（ AOX1）基因啟動子的誘導(dǎo)劑，山梨醇可以加速這種誘導(dǎo)過程。有助于減少誘導(dǎo)時間，醇氧化酶（ AOX1）基因啟動子調(diào)控植酸酶的表達，因此植酸酶的表達量也增加。 基因工程菌發(fā)酵罐培養(yǎng)條件研究 為了使測試結(jié)果在工業(yè)生產(chǎn)中盡快被使用，盡可能早日實現(xiàn)其經(jīng)濟和社會效益，該項目已完成一些前期工作，對 2L 發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)過程中的的一部分工藝進行了研究和優(yōu)化。 本 科 畢 業(yè) 論 文 第 22 頁 共 29 頁 生長階段 pH 研究發(fā)酵罐培養(yǎng)基 pH 值對畢赤酵母的細胞的生長和產(chǎn)酶的影響， pH 值取, ，培養(yǎng)兩小時后，每 4h 測定細胞濃度，用山梨醇 甲醇混合碳源誘導(dǎo)60h 后對活性測定。 pH 值對細胞生長階段的影響如圖 211 所示。 01234567892 6 10 14 18 22培養(yǎng)時間（ h ）菌體濃度（OD600）p H 5 . 0 p H 5 . 5 p H 6 . 0 p H 6 . 5 圖 211 生長階段 pH 對菌體濃度的影響 The effect of pH on yeast concentration at growth phase 從圖 211 可以看出，在發(fā)酵罐的菌體生長階段， pH 值 時，菌體濃度最高，再者就是 pH 為 ，當 pH值 ，細胞濃度最小，所以我們可以看到，過低的 pH值是不利于細菌的生長。 如圖 212 所示的結(jié)果生長階段 pH 值對產(chǎn)酶的影響。 本 科 畢 業(yè) 論 文 第 23 頁 共 29 頁 23242526272829酶活（ K U / m L ）5. 0 5. 5 6. 0 6. 5生長階段培養(yǎng)基 pH 圖 212 生長階段 pH 對產(chǎn)酶的影響 The effect of pH on the production of phytase at growth phase 圖 212 可以看到植酸酶活性隨 pH 值的增加呈上升的趨勢，酶的活性最高是當培養(yǎng)基的 pH 值 時。 綜合圖 211 和 212 的結(jié)果表明，搖瓶發(fā)酵階段階段的工程菌的最適生長 pH 值和最佳表達 pH 值不相同。成長階段是獲得活力細菌，生物量積累為主要目，誘導(dǎo)期再調(diào)整 pH 值，以得到最大活性。因此，選擇生長階段的 pH 值是 。 誘導(dǎo)階段 pH 研究的畢赤酵母發(fā)酵罐培養(yǎng)基 pH 值對細胞的生長和產(chǎn)酶的影響， pH 值取, 五個，培養(yǎng) 2h，每過 4 小時測定細胞濃度，山梨糖醇 甲醇 混合碳源誘導(dǎo) 60h 后，測定的活性測定。 pH 值對細胞的生長和產(chǎn)酶的誘導(dǎo)階段的影響，結(jié)果如圖 212 所示。 182022245. 0 5. 5 6. 0 6. 5 7. 0培養(yǎng)基 pH菌體濃度（OD600）26272829303132酶活（KU/mL）菌體濃度 酶活 圖 212 誘導(dǎo)階段 pH 對菌體濃度和產(chǎn)酶的影響 本 科 畢 業(yè) 論 文 第 24 頁 共 29 頁 The effect of pH on yeast concentration and the production of phytase at inducing phase 圖 212 顯示， pH 值 至 范圍內(nèi)，植酸酶酶活性隨 pH 值的增加而增加，活性達到最大是在 pH 時， pH值超過 ，植酸酶酶活性降低。因此，發(fā)酵 誘導(dǎo)階段時選擇 pH 值為 。 綜合工程菌搖瓶培養(yǎng)階段的最適 pH 發(fā)酵階段的最適 pH 值，發(fā)現(xiàn)無論是搖瓶或發(fā)酵，最適生長 pH 值與最佳產(chǎn)酶 pH 值不相同，搖瓶和發(fā)酵罐之間也有差異。發(fā)酵罐發(fā)酵條件控制優(yōu)于搖瓶。 誘導(dǎo)時間 發(fā)酵階段的誘導(dǎo)時間，從加入碳源誘導(dǎo)每 6h 植酸酶活性測定，結(jié)果如圖 213 所示 051015202530350 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72誘導(dǎo)時間（ h ）酶活力（KU/mL） 圖 213 誘導(dǎo)時間對產(chǎn)酶的影響 The effect of induction time on the production of phytase 圖 213 顯示了前 54 小時， 迅速合成大量的植酸酶，酶活性增加， 54 h 酶的活性不再上升。因此選擇發(fā)酵階段歸納為 54 h。 因此，誘導(dǎo)時間使用混合碳源縮短了 12 小時發(fā)酵周期，繼續(xù)縮短了 6 小時。 本 科 畢 業(yè) 論 文 第 25 頁 共 29 頁 本章小結(jié) 此次實驗通過搖瓶發(fā)酵時對畢赤酵母工程菌酶活性和菌體濃度的研究發(fā)現(xiàn)，畢赤酵母菌種最佳種齡為 22h、最佳菌種接種量 5%、生長階段培養(yǎng)基最適 pH 值為 、誘導(dǎo)階段培養(yǎng)基最適 pH值為 ，甲醇的每天添加量 小時補加一次，誘導(dǎo)所需時間為 72h 以及采用混合碳源山梨醇 甲醇對誘導(dǎo)要優(yōu)于甲醇單一碳源 ， 25%山梨醇和甲醇的最佳比例（ V/V）為 1∶ 6。最終酶活達到 25365U/mL 發(fā)酵液。 通過對畢赤酵母發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶的培養(yǎng)階段，以及生長階段最適 pH 值，誘導(dǎo)階段的最適 pH 值以及最佳的誘導(dǎo)時間進行了研究，最終確定了發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)畢赤酵母產(chǎn)植酸酶的最佳發(fā)酵條件。發(fā)酵罐發(fā)酵的生長階段培養(yǎng)基最適 pH 值為 ，發(fā)酵罐發(fā)酵的誘導(dǎo)階段培養(yǎng)基最適 pH 值為 ，搖瓶培養(yǎng)畢赤酵母條件與這些不同。試驗確定發(fā)酵罐發(fā)酵畢赤酵母產(chǎn)植酸酶培養(yǎng)階段的最適的誘導(dǎo)時間是 54h。發(fā)酵完畢后最終的植酸酶酶活性達到了 31985U/mL 發(fā) 酵液。 本 科 畢 業(yè) 論 文 第 26 頁 共 29 頁 結(jié) 論 本論文初步介紹了植酸酶的基本知識，包括植酸酶分類、植酸酶來源、植酸酶應(yīng)用等基本概況，并從兩部分實驗研究畢赤酵母工程菌發(fā)酵產(chǎn)植酸酶的搖瓶培養(yǎng)實驗和發(fā)酵罐培養(yǎng)實驗，兩個部分討論了若干影響因素對畢赤酵母植酸酶表達的影響因素，并將發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。 發(fā)酵產(chǎn)植酸酶過程中的影響因素研究及其發(fā)酵條件的優(yōu)化 通過對畢赤酵母工程菌發(fā)酵產(chǎn)植酸酶的搖瓶培養(yǎng)實驗和發(fā)酵罐培養(yǎng)實驗過程影響因素的研究，將發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，使發(fā)酵產(chǎn)的植酸酶的酶活性得到了很大的提升。對畢赤酵母進行誘導(dǎo)產(chǎn)酶，使用山梨醇 甲醇混合碳 源，發(fā)現(xiàn)使用山梨醇 甲醇混合碳源酶活性高于甲醇作為唯一碳源，最終酶活達 31985U/mL 發(fā)酵液。 本 科 畢 業(yè) 論 文 第 27 頁 共 29 頁 參考文獻 1 李洪淼 .植酸酶畢赤酵母基因工程菌 [D] .四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文， 20xx,6 月 2 李曉龍 , 楊合同 , 吳遠征 , 等 . 植酸酶的多樣性及其分類 [J] . 農(nóng)產(chǎn)食品科技 , 20xx,5 月 3 杜麗敏 , 段相林 . 植酸酶的來源與應(yīng)用 [J]. 安徽農(nóng)業(yè)科技 , 20xx, 8 月 4 施安輝 , 王光玉 . 目前國內(nèi)外植酸酶研究進展 [ J] . 中國釀造 , 20xx( 5) : 5~ 10. 5 李秀娟 , 尹玲 , 李秀珍 , 黃賢剛 . 植酸酶畢赤酵母基因工程菌發(fā)酵條件的優(yōu)化[J] . 20xx, 5 月 6 汪世華 , 呂茂洲 , 孫長春 , 等 . 植酸酶的現(xiàn)狀及其研究進展 . 20xx, 9 月 7 楊燕凌 , 沙莉 , 方金銅 . 微生物植酸酶的研究與應(yīng)用 . 武夷科學(xué) , 20xx, 23: 191195 8 郭會燦 , 杜娜 . 植酸酶在工業(yè)中的應(yīng)用 . 河北工業(yè) , 20xx, 31(11): 1011 9 葉冰 , 王運吉 , 張苓花 . 植酸酶畢赤酵母基因工程菌高密度發(fā)酵 . 大連輕工業(yè)學(xué)報 , 20xx, 21(3): 193196 10 周德慶 . 微生物學(xué)教程 . 第 2 版 . 北京：高等教育出版社 , 20xx: 159160 11 M. HASSLACHER, M. Schall, M. HAYN, et al. Highlevel Intracellular Expression of Hydroxyl nitrile Lyase from the Tropical Rubber Tree Hevea Brasiliensis in Microbial Hosts. Protein Expres Purif, 1997, 11(1): 6171 12 A. S. XIONG, Q. H. YAO, R. H. PENG, et al. Highlevel Expression of a Synthetic Gene Encoding Peniophora Lycii Phytase in Methylotrophic Yeast Pichia Microbiol Biotechnol, 20xx, 72(5): 10391047 13 K. SANO, H. FUKUHARA, Y. NAKAMURA. Phytase of the Yast Arxula Adeninivorans. Biotec hnol. Lett, 1999, 21: 3338 14 T. R. SHIEH, J. H. WARE. Survey of Microanisms for the Production of Extracellular Phytase. Appl. Microbiol, 1968, 169(9): 13481351 15 C. LAMBRECHTS, H. BOZE, G. MOULIN, et al. Utilization of Phytase by Some Yeast. Biotechnol. Lett, 1992, 14(1): 6366 16 A. VOHRA, T. SATYANARAYANA. Statistial Optimization of the Medium 本 科 畢 業(yè) 論 文 第 28 頁 共 29 頁 Components by Response Surface Methodology to Enhance Phytase Production by Pichia Biochem, 20xx, 37: 9991004