【導(dǎo)讀】在廣大農(nóng)村，分散而且低密度的圈養(yǎng)條件下，動(dòng)物的排泄物是一種非常好的有。飼養(yǎng)規(guī)模急劇增加，必然導(dǎo)致在較小的面積上產(chǎn)生出大料的排泄物。合理的分散和處理，便會(huì)對(duì)周?chē)沫h(huán)境造成嚴(yán)重的污染。胃中缺乏植酸酶，對(duì)植物性飼料中的磷的利用率非常低，為滿(mǎn)足單胃動(dòng)物對(duì)磷的需求量，目前，國(guó)內(nèi)外大量的實(shí)驗(yàn)證明，在家。畜的飼料中添加植酸酶可以提高家畜對(duì)磷的利用率，從而可以減少向環(huán)境中排放的磷。在飼料中添加少量的植酸酶可以代替添加大量?jī)r(jià)格昂貴的無(wú)機(jī)。磷酸鈣，使飼料成本降低，而飼料的綜合利用率提高。植酸酶還能消除植酸對(duì)多種金屬。植酸酶因其多方面的應(yīng)用特點(diǎn)，植酸酶已成為飼料、醫(yī)學(xué)、人類(lèi)營(yíng)養(yǎng)、食品。③磷在機(jī)體內(nèi)參與碳水化合物的代謝和運(yùn)輸，如在光合作用和呼吸作用的。生理過(guò)程中，糖的合成、轉(zhuǎn)化、降解大多數(shù)是在磷酸化以后才起反應(yīng)的。⑤磷還與脂肪轉(zhuǎn)化有關(guān)，脂肪代謝需要NADPH、ATP、CoA和NAD+. 68%-80%的磷在植物性飼料中都是以植酸的方式存在[1]。

　　

【正文】 12 小時(shí)酶活性增加非常緩慢，因?yàn)楣こ叹€未適應(yīng)甲醇環(huán)境，工程菌誘導(dǎo)后 12 小時(shí)后， 已適應(yīng)甲醇的環(huán)境，并開(kāi)始產(chǎn)生植酸酶，酶活先快后慢，最終穩(wěn)定下來(lái)，活性不再增加。甲醇為唯一碳源誘導(dǎo)時(shí)，誘導(dǎo) 72 小時(shí)酶活性最大的，為 22367 U/mL。使用山梨醇 甲醇混合碳源時(shí)在 60h 活性最大，為25365U/mL。 因此，混合碳源的利用，不僅可以增加植酸酶的表達(dá)量，而且還縮短了誘導(dǎo)時(shí)間，因?yàn)榧状际谴佳趸福?AOX1）基因啟動(dòng)子的誘導(dǎo)劑，山梨醇可以加速這種誘導(dǎo)過(guò)程。有助于減少誘導(dǎo)時(shí)間，醇氧化酶（ AOX1）基因啟動(dòng)子調(diào)控植酸酶的表達(dá)，因此植酸酶的表達(dá)量也增加。 基因工程菌發(fā)酵罐培養(yǎng)條件研究 為了使測(cè)試結(jié)果在工業(yè)生產(chǎn)中盡快被使用，盡可能早日實(shí)現(xiàn)其經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益，該項(xiàng)目已完成一些前期工作，對(duì) 2L 發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中的的一部分工藝進(jìn)行了研究和優(yōu)化。 本 科 畢 業(yè) 論 文 第 22 頁(yè) 共 29 頁(yè) 生長(zhǎng)階段 pH 研究發(fā)酵罐培養(yǎng)基 pH 值對(duì)畢赤酵母的細(xì)胞的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響， pH 值取, ，培養(yǎng)兩小時(shí)后，每 4h 測(cè)定細(xì)胞濃度，用山梨醇 甲醇混合碳源誘導(dǎo)60h 后對(duì)活性測(cè)定。 pH 值對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)階段的影響如圖 211 所示。 01234567892 6 10 14 18 22培養(yǎng)時(shí)間（ h ）菌體濃度（OD600）p H 5 . 0 p H 5 . 5 p H 6 . 0 p H 6 . 5 圖 211 生長(zhǎng)階段 pH 對(duì)菌體濃度的影響 The effect of pH on yeast concentration at growth phase 從圖 211 可以看出，在發(fā)酵罐的菌體生長(zhǎng)階段， pH 值 時(shí)，菌體濃度最高，再者就是 pH 為 ，當(dāng) pH值 ，細(xì)胞濃度最小，所以我們可以看到，過(guò)低的 pH值是不利于細(xì)菌的生長(zhǎng)。 如圖 212 所示的結(jié)果生長(zhǎng)階段 pH 值對(duì)產(chǎn)酶的影響。 本 科 畢 業(yè) 論 文 第 23 頁(yè) 共 29 頁(yè) 23242526272829酶活（ K U / m L ）5. 0 5. 5 6. 0 6. 5生長(zhǎng)階段培養(yǎng)基 pH 圖 212 生長(zhǎng)階段 pH 對(duì)產(chǎn)酶的影響 The effect of pH on the production of phytase at growth phase 圖 212 可以看到植酸酶活性隨 pH 值的增加呈上升的趨勢(shì)，酶的活性最高是當(dāng)培養(yǎng)基的 pH 值 時(shí)。 綜合圖 211 和 212 的結(jié)果表明，搖瓶發(fā)酵階段階段的工程菌的最適生長(zhǎng) pH 值和最佳表達(dá) pH 值不相同。成長(zhǎng)階段是獲得活力細(xì)菌，生物量積累為主要目，誘導(dǎo)期再調(diào)整 pH 值，以得到最大活性。因此，選擇生長(zhǎng)階段的 pH 值是 。 誘導(dǎo)階段 pH 研究的畢赤酵母發(fā)酵罐培養(yǎng)基 pH 值對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響， pH 值取, 五個(gè)，培養(yǎng) 2h，每過(guò) 4 小時(shí)測(cè)定細(xì)胞濃度，山梨糖醇 甲醇 混合碳源誘導(dǎo) 60h 后，測(cè)定的活性測(cè)定。 pH 值對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的誘導(dǎo)階段的影響，結(jié)果如圖 212 所示。 182022245. 0 5. 5 6. 0 6. 5 7. 0培養(yǎng)基 pH菌體濃度（OD600）26272829303132酶活（KU/mL）菌體濃度 酶活 圖 212 誘導(dǎo)階段 pH 對(duì)菌體濃度和產(chǎn)酶的影響 本 科 畢 業(yè) 論 文 第 24 頁(yè) 共 29 頁(yè) The effect of pH on yeast concentration and the production of phytase at inducing phase 圖 212 顯示， pH 值 至 范圍內(nèi)，植酸酶酶活性隨 pH 值的增加而增加，活性達(dá)到最大是在 pH 時(shí)， pH值超過(guò) ，植酸酶酶活性降低。因此，發(fā)酵 誘導(dǎo)階段時(shí)選擇 pH 值為 。 綜合工程菌搖瓶培養(yǎng)階段的最適 pH 發(fā)酵階段的最適 pH 值，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是搖瓶或發(fā)酵，最適生長(zhǎng) pH 值與最佳產(chǎn)酶 pH 值不相同，搖瓶和發(fā)酵罐之間也有差異。發(fā)酵罐發(fā)酵條件控制優(yōu)于搖瓶。 誘導(dǎo)時(shí)間 發(fā)酵階段的誘導(dǎo)時(shí)間，從加入碳源誘導(dǎo)每 6h 植酸酶活性測(cè)定，結(jié)果如圖 213 所示 051015202530350 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72誘導(dǎo)時(shí)間（ h ）酶活力（KU/mL） 圖 213 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響 The effect of induction time on the production of phytase 圖 213 顯示了前 54 小時(shí)， 迅速合成大量的植酸酶，酶活性增加， 54 h 酶的活性不再上升。因此選擇發(fā)酵階段歸納為 54 h。 因此，誘導(dǎo)時(shí)間使用混合碳源縮短了 12 小時(shí)發(fā)酵周期，繼續(xù)縮短了 6 小時(shí)。 本 科 畢 業(yè) 論 文 第 25 頁(yè) 共 29 頁(yè) 本章小結(jié) 此次實(shí)驗(yàn)通過(guò)搖瓶發(fā)酵時(shí)對(duì)畢赤酵母工程菌酶活性和菌體濃度的研究發(fā)現(xiàn)，畢赤酵母菌種最佳種齡為 22h、最佳菌種接種量 5%、生長(zhǎng)階段培養(yǎng)基最適 pH 值為 、誘導(dǎo)階段培養(yǎng)基最適 pH值為 ，甲醇的每天添加量 小時(shí)補(bǔ)加一次，誘導(dǎo)所需時(shí)間為 72h 以及采用混合碳源山梨醇 甲醇對(duì)誘導(dǎo)要優(yōu)于甲醇單一碳源 ， 25%山梨醇和甲醇的最佳比例（ V/V）為 1∶ 6。最終酶活達(dá)到 25365U/mL 發(fā)酵液。 通過(guò)對(duì)畢赤酵母發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶的培養(yǎng)階段，以及生長(zhǎng)階段最適 pH 值，誘導(dǎo)階段的最適 pH 值以及最佳的誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行了研究，最終確定了發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)畢赤酵母產(chǎn)植酸酶的最佳發(fā)酵條件。發(fā)酵罐發(fā)酵的生長(zhǎng)階段培養(yǎng)基最適 pH 值為 ，發(fā)酵罐發(fā)酵的誘導(dǎo)階段培養(yǎng)基最適 pH 值為 ，搖瓶培養(yǎng)畢赤酵母條件與這些不同。試驗(yàn)確定發(fā)酵罐發(fā)酵畢赤酵母產(chǎn)植酸酶培養(yǎng)階段的最適的誘導(dǎo)時(shí)間是 54h。發(fā)酵完畢后最終的植酸酶酶活性達(dá)到了 31985U/mL 發(fā) 酵液。 本 科 畢 業(yè) 論 文 第 26 頁(yè) 共 29 頁(yè) 結(jié) 論 本論文初步介紹了植酸酶的基本知識(shí)，包括植酸酶分類(lèi)、植酸酶來(lái)源、植酸酶應(yīng)用等基本概況，并從兩部分實(shí)驗(yàn)研究畢赤酵母工程菌發(fā)酵產(chǎn)植酸酶的搖瓶培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和發(fā)酵罐培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，兩個(gè)部分討論了若干影響因素對(duì)畢赤酵母植酸酶表達(dá)的影響因素，并將發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。 發(fā)酵產(chǎn)植酸酶過(guò)程中的影響因素研究及其發(fā)酵條件的優(yōu)化 通過(guò)對(duì)畢赤酵母工程菌發(fā)酵產(chǎn)植酸酶的搖瓶培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和發(fā)酵罐培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)過(guò)程影響因素的研究，將發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，使發(fā)酵產(chǎn)的植酸酶的酶活性得到了很大的提升。對(duì)畢赤酵母進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)酶，使用山梨醇 甲醇混合碳 源，發(fā)現(xiàn)使用山梨醇 甲醇混合碳源酶活性高于甲醇作為唯一碳源，最終酶活達(dá) 31985U/mL 發(fā)酵液。 本 科 畢 業(yè) 論 文 第 27 頁(yè) 共 29 頁(yè) 參考文獻(xiàn) 1 李洪淼 .植酸酶畢赤酵母基因工程菌 [D] .四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文， 20xx,6 月 2 李曉龍 , 楊合同 , 吳遠(yuǎn)征 , 等 . 植酸酶的多樣性及其分類(lèi) [J] . 農(nóng)產(chǎn)食品科技 , 20xx,5 月 3 杜麗敏 , 段相林 . 植酸酶的來(lái)源與應(yīng)用 [J]. 安徽農(nóng)業(yè)科技 , 20xx, 8 月 4 施安輝 , 王光玉 . 目前國(guó)內(nèi)外植酸酶研究進(jìn)展 [ J] . 中國(guó)釀造 , 20xx( 5) : 5~ 10. 5 李秀娟 , 尹玲 , 李秀珍 , 黃賢剛 . 植酸酶畢赤酵母基因工程菌發(fā)酵條件的優(yōu)化[J] . 20xx, 5 月 6 汪世華 , 呂茂洲 , 孫長(zhǎng)春 , 等 . 植酸酶的現(xiàn)狀及其研究進(jìn)展 . 20xx, 9 月 7 楊燕凌 , 沙莉 , 方金銅 . 微生物植酸酶的研究與應(yīng)用 . 武夷科學(xué) , 20xx, 23: 191195 8 郭會(huì)燦 , 杜娜 . 植酸酶在工業(yè)中的應(yīng)用 . 河北工業(yè) , 20xx, 31(11): 1011 9 葉冰 , 王運(yùn)吉 , 張苓花 . 植酸酶畢赤酵母基因工程菌高密度發(fā)酵 . 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