現(xiàn)代分子診斷技術(shù)詳述-資料下載頁(yè)
2025-03-04 14:47本頁(yè)面
【正文】 止 3’G 5’ TACCTTAGGTT 3’ 3’ GAATCCAA 5’ PCR反應(yīng)繼續(xù) 野生型序列 突變序列 野生型引物 突變引物 ARMS原理示意圖 野生型 DNA A T T 3’ 引物 3 發(fā)紅光 C G T 3’ 引物 3 無(wú)法擴(kuò)增沒(méi)有熒光 A ARMS檢測(cè)突變體舉例 純合突變體 DNA C G G3’ 引物 3 發(fā)綠光 A T G 3’ 引物 3 無(wú)法擴(kuò)增沒(méi)有熒光 B ARMS檢測(cè)突變體舉例 雜合突變體 DNA A G T 3’ 引物 3 G 發(fā)黃光 C ARMS檢測(cè)突變體舉例 T C 引物 1 引物 2 G T 六、連接酶鏈反應(yīng) ?基本原理 ? 利用 DNA連接酶特異地將雙鏈 DNA片段連接，經(jīng)變性 退火 連接三步驟反復(fù)循環(huán)，從而使靶基因序列大量擴(kuò)增 ? 設(shè)計(jì)兩對(duì)分別互補(bǔ)的引物，引物與之互補(bǔ)的模板DNA結(jié)合并留下一缺口，如果與靶序列雜交的相鄰的寡核苷酸引物與靶序列完全互補(bǔ)， DNA連接酶即可連接封閉這一缺口，則 LCR反應(yīng)的三步驟(變性 退火 連接 )就能反復(fù)進(jìn)行，若連接處的靶序列有點(diǎn)突變，引物不能與靶序列精確結(jié)合，缺口附近核苷酸的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，連接反應(yīng)不能進(jìn)行，也就不能形成連接產(chǎn)物 第五節(jié) 基因工程疫苗 一、疫苗的簡(jiǎn)介 二、基因工程疫苗 亞單位疫苗 肽基疫苗 DNA疫苗 一、疫苗的簡(jiǎn)介 ? Dr Edward Jener（ 1796）： 用一種奶牛痘感染人類，感染后不再被天花感染 ? Louis Pasteur （ 19世紀(jì)末）： 研制成功狂犬疫苗 ? Von Behring ＆ Kitasato Shibasaburo： 開(kāi)發(fā)研制白喉 /破傷風(fēng)疫苗 ? 醫(yī)學(xué)上最有潛力的防御物質(zhì) ? 滅活的和減毒的致病物質(zhì) 不能喪失引起免疫反應(yīng)的能力 ? 麻疹、白喉、百日咳、破傷風(fēng)、天花、脊髓灰質(zhì)炎 傳統(tǒng)疫苗的局限性 ①有些致病物無(wú)法在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)； ②動(dòng)物和人類的病毒需要在動(dòng)物細(xì)胞中培養(yǎng)； ③培養(yǎng)的動(dòng)物和人類病毒其生長(zhǎng)速度和產(chǎn)量一般都很低； ④需要對(duì)實(shí)驗(yàn)室以及參加實(shí)驗(yàn)的操作人員采取特殊的保護(hù)措施； ⑤疫苗中的致病物質(zhì)在疫苗生產(chǎn)過(guò)程中又可能沒(méi)有完全殺死或充分減毒； ⑥減毒菌株有可能發(fā)生突變； ⑦有些疾病（如艾滋?。┯脗鹘y(tǒng)的疫苗防治收效甚微； ⑧絕大多數(shù)的現(xiàn)行疫苗的有效期短。 衡量疫苗能否投入使用的標(biāo)準(zhǔn) ?—— 安全性 刪除致病基因，保留抗原性。 ?—— 有效性 盡可能調(diào)動(dòng)機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫。 ? 免疫系統(tǒng)的工作機(jī)制： 體液免疫、細(xì)胞免疫 抗原 抗原肽 細(xì)胞表面復(fù)合物 活化的 B細(xì)胞（漿細(xì)胞） 淋巴因子 活化的 T細(xì)胞 抗體 殺滅抗原分子 抗原顯示細(xì)胞（如樹(shù)狀細(xì)胞 ） 吞噬，分解 MHC蛋白質(zhì) 識(shí)別、激活 殺傷 T細(xì)胞 激活釋放 激活 分泌 體液免疫 細(xì)胞免疫 二、基因工程疫苗 ?指用基因工程的方法，表達(dá)出病原物的一段基因序列，將表達(dá)產(chǎn)物（多數(shù)是無(wú)毒性、無(wú)感染能力，但具有較強(qiáng)的免疫原性）用作疫苗 亞單位疫苗 ? 利用病原物的某一部分制得的疫苗 ? 明確編碼具有免疫活性的特定抗原的 DNA，一般選擇病原體表面糖蛋白編碼基因 ? 對(duì)于易變異的病毒 (如 A型流感病毒 )則可選擇各亞型共有的核心蛋白的主要保護(hù)性抗原基因序列 ? 應(yīng)用重組 DNA技術(shù)研制亞單位疫苗，還必須有合適的表達(dá)系統(tǒng)用來(lái)生產(chǎn)基因產(chǎn)物 ?優(yōu)點(diǎn)： ①避免了直接使用病原物而使接受者可能致病的危險(xiǎn) ②亞單位疫苗利用純化的蛋白質(zhì)作為免疫源，可以避免由于外源蛋白、核酸的混雜等造成的種種副作用 ③有時(shí)單獨(dú)使用特異蛋白能增加疫苗的效果 局限性： ①純化單一的蛋白質(zhì)十分昂貴 ②純化后的蛋白質(zhì)的構(gòu)象與在體內(nèi)可能不同，從而導(dǎo)致抗原性發(fā)生變化 ③ 亞單位疫苗一般不具有感染性 不能激活 MHCI分子，也很難激活殺傷性 T細(xì)胞，激活的免疫反應(yīng)一般較弱 制備亞單位疫苗的基本前提是鑒定出病原物中哪些成分能激活機(jī)體產(chǎn)生抗體 肽疫苗 衣殼蛋白組成的外殼 病毒衣殼 病毒核酸 短肽 銜接物 ? 只有位于病毒衣殼外表可以與抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)域才能引起免疫反應(yīng) ? 類似于抗原決定簇的小肽充當(dāng)疫苗 ? 雙肽：兩個(gè)肽段連接形成一個(gè)較長(zhǎng)的肽 不用載體蛋白保護(hù)，比其他任何一個(gè)肽段單獨(dú)使用更加有效 ? 與強(qiáng)免疫原性的載體蛋白－乙肝核心蛋白基因連接 ? 限制因素： ①充當(dāng)抗原抗原決定簇的肽段不能太長(zhǎng)，而且要連續(xù) ②要求肽段的構(gòu)象必須與完整病毒上的抗原決定簇構(gòu)象一致 ③要求選定的單一抗原決定簇必須要有足夠強(qiáng)的免疫原性 三、 DNA免疫 ? 基因免疫、核酸免疫 ? Wolf （ 1993）將流感病毒核蛋白 P抗原基因直接注射到小鼠骨骼肌引起免疫反應(yīng)，產(chǎn)生多種亞型 TK細(xì)胞。 ? 目前已經(jīng)進(jìn)行的研究： 輪狀病毒、單純皰疹病毒、乙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒、狂犬病毒、結(jié)核桿菌亞單位疫苗等 ? “裸” DNA疫苗 ? 不含肽、蛋白質(zhì)或病毒載體 ，只是由來(lái)源于病原體的一個(gè)抗原編碼基因及作為其載體的質(zhì)粒 DNA組成 ? 這段抗原編碼基因可在活體細(xì)胞中控制合成抗原蛋白，從而引起免疫反應(yīng) 優(yōu)越性 ? DNA比蛋白質(zhì)更穩(wěn)定， DNA在制成干粉后可以保存的時(shí)間較長(zhǎng) ? 大規(guī)模生產(chǎn)比蛋白容易，成本低 ? 任何 DNA片段都可以插入質(zhì)粒中制成疫苗，而且在同一質(zhì)粒上可以同時(shí)容納一個(gè)以上的抗原基因 ? DNA疫苗對(duì)于目前難以用常規(guī)疫苗防治的疾病的預(yù)防和治療有重要的意義 ? 用于癌癥等疑難疾病治療 局限性 ? 免疫效力低，劑量越大，所引起的免疫反應(yīng)越強(qiáng)； ? 接種在體內(nèi)的 DNA的最終下落尚不清楚（有可能最終被細(xì)胞內(nèi)的各種酶所降解，也有可能 DNA整合入宿主基因組）
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