真核表達系統(tǒng)的選擇和高效表達策略-資料下載頁
2025-02-20 04:33本頁面
【正文】 帶外源基因的拷貝數能夠在一定程度上提高表達量 ,因此篩選出多拷貝轉化子來提高產量是一個簡單容易實施的策略。 常用的方法是使用帶有抗性標記的載體 ,通過工程菌對抗生素的耐受力的不同來進行多拷貝篩選 ,耐受抗生素濃度越高意味攜帶的拷貝越多 。商業(yè)化的抗性標記有卡那霉素抗性基因 (在酵母中耐受 G418) ,細菌shble基因 (在酵母中耐受 Zeocin) 。此外還可以使用攜帶多拷貝表達盒的載體進行轉化來獲得多拷貝轉化子。國外也有報導在大腸桿菌引入轉座子 ,在大腸桿菌階段利用抗生素濃度篩選攜帶多拷貝目的基因的質粒。 ? 然而也有不少實驗表明 ,拷貝數越多并不一定意味表達量越大 ,如果要確定多拷貝策略對提高特定目的基因產量是否有效 ,需要同時篩選出單拷貝載體與多拷貝載體并對兩者進行產量對比才能得到影響結果。通常采取利用酵母轉化子耐受的最高抗生素濃度的方法快速粗略判定拷貝的數目。 基因劑量 ? 一般來說 ,高拷貝整合可以提高表達量 , 如 Jeffrey 等發(fā)現 , 重組 CD40L 的最高產量是在有 8 個以上拷貝的菌株中獲得。但許多實例表明 ,含單拷貝表達框的宿主菌足以得到最佳產量。 個別情況下拷貝數增加對產量也會產生負效應 ,原因可能在于過高表達會對分泌途徑產生負反饋抑制 。 因此 ,高表達菌株的篩選只應以表達的蛋白量為唯一標準 ,基因劑量與表達水平的關系取決于特定的外源蛋 ? 白。 分泌信號 ? 不適合的信號肽可導致信號肽加工不完全 ,或者蛋白分泌水平低 ,甚至不能分泌 。 嘗試不同的信號肽 ,對信號肽進行突變改造或人工全合成信號肽等策略可用于實現信號肽正確加工和提高分泌水平 。 . 韋宇拓等利用菊粉酶的信號肽序列來構建巴斯德畢赤酵母分泌載體并表達了 B2葡聚糖酶 ,結果表明ISP 信號肽序列分泌效率不低于利用 α因子 ? 信號肽的表達載體 pPIC9 K。 Singh 等通過定向缺 ? 失誘變導致了含有天然 N 端的成熟干擾素的正確 ? 釋放 ,可以成為解決這一問題的一種好方法 。 培養(yǎng)條件的優(yōu)化 ? 畢赤酵母可以通過不同整合方式得到三個表型 ,其中 Mut+能夠快速利用甲醇 ,MutS利用得慢 ,Mut不能利用甲醇生長 。表型的選擇一般由需要表達的蛋白而決定 。 由于畢赤酵母可以高密度培養(yǎng) ,外源蛋白對酵母沒有特別影響時通常酵母密度越大蛋白分泌量越大 ,因此一般使用 Mut+型的轉化子 ,這樣在甲醇的誘導下也能利用甲醇來增殖 。 也有個別例子是 MutS型的蛋白分泌量較大 ,這可能是由于 MutS 型在誘導階段長得慢些 ,蛋白反而能夠正確折疊加工 ,也有些是因為外源蛋白有細胞毒性 ,濃度高會對畢赤酵母生長有不良影響 ,產生反饋抑制 。 誘導表達時甲醇的用量為發(fā)酵液總體積的 %～ 3%之間 ,甲醇濃度太高將會產生毒性 。 可以采取一定時間內補加甲醇的措施 ,彌補消耗掉的甲醇 。 大量的資料表明誘導時間在 3 d～ 5 d之間最好 ,時間再長對蛋白的表達通常沒有什么幫助 ,因為前期分泌出來的蛋白有被降解的可能 。 培養(yǎng)條件的優(yōu)化 ? 畢赤酵母表達外源產物最合適 pH通常是 ～， 溫度在 28℃ ～ 30℃ 之間 ,并且需要較快的搖瓶速度提供較多氧氣和傳遞發(fā)酵產生的熱量 ,同時接種量也需要控制在一定的范圍 。 雖然酵母的菌體密度越大越好 ,表達量也相應的有一定提高 ,這也是畢赤酵母的突出優(yōu)點 ,但菌體的密度同時會受到供氧和營養(yǎng)供給及蛋白降解等限制 ,需要通過實驗來進行優(yōu)化 。 培養(yǎng)條件的優(yōu)化 ? 長時間的誘導表達 ,外源蛋白有可能被降解 。 在發(fā)酵罐大規(guī)模生產時 ,蛋白降解的影響更為嚴重 ,常需要采取不同的方法防止外源蛋白降解 。 一般有下面幾種方法 :使用蛋白缺陷型菌株 (如 SMD1168) ,減少蛋白水解酶的影響 。在培養(yǎng)基中添加蛋白胨或者酪蛋白水解產物來抑制水解 。利用酵母可以在較寬的 pH下生長的特點嘗試調節(jié)磷酸鹽緩沖液的 pH以抑制水解 。 此外調整培養(yǎng)基的配料如氮源 、 在添加甲醇前徹底去除甘油以減少表達抑制 、 糖基化的優(yōu)化等措施都有相應例子實現蛋白產量的提高 。
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