真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略-資料下載頁(yè)
2025-02-20 04:33本頁(yè)面
【正文】 帶外源基因的拷貝數(shù)能夠在一定程度上提高表達(dá)量 ,因此篩選出多拷貝轉(zhuǎn)化子來提高產(chǎn)量是一個(gè)簡(jiǎn)單容易實(shí)施的策略。 常用的方法是使用帶有抗性標(biāo)記的載體 ,通過工程菌對(duì)抗生素的耐受力的不同來進(jìn)行多拷貝篩選 ,耐受抗生素濃度越高意味攜帶的拷貝越多 。商業(yè)化的抗性標(biāo)記有卡那霉素抗性基因 (在酵母中耐受 G418) ,細(xì)菌shble基因 (在酵母中耐受 Zeocin) 。此外還可以使用攜帶多拷貝表達(dá)盒的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化來獲得多拷貝轉(zhuǎn)化子。國(guó)外也有報(bào)導(dǎo)在大腸桿菌引入轉(zhuǎn)座子 ,在大腸桿菌階段利用抗生素濃度篩選攜帶多拷貝目的基因的質(zhì)粒。 ? 然而也有不少實(shí)驗(yàn)表明 ,拷貝數(shù)越多并不一定意味表達(dá)量越大 ,如果要確定多拷貝策略對(duì)提高特定目的基因產(chǎn)量是否有效 ,需要同時(shí)篩選出單拷貝載體與多拷貝載體并對(duì)兩者進(jìn)行產(chǎn)量對(duì)比才能得到影響結(jié)果。通常采取利用酵母轉(zhuǎn)化子耐受的最高抗生素濃度的方法快速粗略判定拷貝的數(shù)目。 基因劑量 ? 一般來說 ,高拷貝整合可以提高表達(dá)量 , 如 Jeffrey 等發(fā)現(xiàn) , 重組 CD40L 的最高產(chǎn)量是在有 8 個(gè)以上拷貝的菌株中獲得。但許多實(shí)例表明 ,含單拷貝表達(dá)框的宿主菌足以得到最佳產(chǎn)量。 個(gè)別情況下拷貝數(shù)增加對(duì)產(chǎn)量也會(huì)產(chǎn)生負(fù)效應(yīng) ,原因可能在于過高表達(dá)會(huì)對(duì)分泌途徑產(chǎn)生負(fù)反饋抑制 。 因此 ,高表達(dá)菌株的篩選只應(yīng)以表達(dá)的蛋白量為唯一標(biāo)準(zhǔn) ,基因劑量與表達(dá)水平的關(guān)系取決于特定的外源蛋 ? 白。 分泌信號(hào) ? 不適合的信號(hào)肽可導(dǎo)致信號(hào)肽加工不完全 ,或者蛋白分泌水平低 ,甚至不能分泌 。 嘗試不同的信號(hào)肽 ,對(duì)信號(hào)肽進(jìn)行突變改造或人工全合成信號(hào)肽等策略可用于實(shí)現(xiàn)信號(hào)肽正確加工和提高分泌水平 。 . 韋宇拓等利用菊粉酶的信號(hào)肽序列來構(gòu)建巴斯德畢赤酵母分泌載體并表達(dá)了 B2葡聚糖酶 ,結(jié)果表明ISP 信號(hào)肽序列分泌效率不低于利用 α因子 ? 信號(hào)肽的表達(dá)載體 pPIC9 K。 Singh 等通過定向缺 ? 失誘變導(dǎo)致了含有天然 N 端的成熟干擾素的正確 ? 釋放 ,可以成為解決這一問題的一種好方法 。 培養(yǎng)條件的優(yōu)化 ? 畢赤酵母可以通過不同整合方式得到三個(gè)表型 ,其中 Mut+能夠快速利用甲醇 ,MutS利用得慢 ,Mut不能利用甲醇生長(zhǎng) 。表型的選擇一般由需要表達(dá)的蛋白而決定 。 由于畢赤酵母可以高密度培養(yǎng) ,外源蛋白對(duì)酵母沒有特別影響時(shí)通常酵母密度越大蛋白分泌量越大 ,因此一般使用 Mut+型的轉(zhuǎn)化子 ,這樣在甲醇的誘導(dǎo)下也能利用甲醇來增殖 。 也有個(gè)別例子是 MutS型的蛋白分泌量較大 ,這可能是由于 MutS 型在誘導(dǎo)階段長(zhǎng)得慢些 ,蛋白反而能夠正確折疊加工 ,也有些是因?yàn)橥庠吹鞍子屑?xì)胞毒性 ,濃度高會(huì)對(duì)畢赤酵母生長(zhǎng)有不良影響 ,產(chǎn)生反饋抑制 。 誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)甲醇的用量為發(fā)酵液總體積的 %～ 3%之間 ,甲醇濃度太高將會(huì)產(chǎn)生毒性 。 可以采取一定時(shí)間內(nèi)補(bǔ)加甲醇的措施 ,彌補(bǔ)消耗掉的甲醇 。 大量的資料表明誘導(dǎo)時(shí)間在 3 d～ 5 d之間最好 ,時(shí)間再長(zhǎng)對(duì)蛋白的表達(dá)通常沒有什么幫助 ,因?yàn)榍捌诜置诔鰜淼牡鞍子斜唤到獾目赡?。 培養(yǎng)條件的優(yōu)化 ? 畢赤酵母表達(dá)外源產(chǎn)物最合適 pH通常是 ～， 溫度在 28℃ ～ 30℃ 之間 ,并且需要較快的搖瓶速度提供較多氧氣和傳遞發(fā)酵產(chǎn)生的熱量 ,同時(shí)接種量也需要控制在一定的范圍 。 雖然酵母的菌體密度越大越好 ,表達(dá)量也相應(yīng)的有一定提高 ,這也是畢赤酵母的突出優(yōu)點(diǎn) ,但菌體的密度同時(shí)會(huì)受到供氧和營(yíng)養(yǎng)供給及蛋白降解等限制 ,需要通過實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行優(yōu)化 。 培養(yǎng)條件的優(yōu)化 ? 長(zhǎng)時(shí)間的誘導(dǎo)表達(dá) ,外源蛋白有可能被降解 。 在發(fā)酵罐大規(guī)模生產(chǎn)時(shí) ,蛋白降解的影響更為嚴(yán)重 ,常需要采取不同的方法防止外源蛋白降解 。 一般有下面幾種方法 :使用蛋白缺陷型菌株 (如 SMD1168) ,減少蛋白水解酶的影響 。在培養(yǎng)基中添加蛋白胨或者酪蛋白水解產(chǎn)物來抑制水解 。利用酵母可以在較寬的 pH下生長(zhǎng)的特點(diǎn)嘗試調(diào)節(jié)磷酸鹽緩沖液的 pH以抑制水解 。 此外調(diào)整培養(yǎng)基的配料如氮源 、 在添加甲醇前徹底去除甘油以減少表達(dá)抑制 、 糖基化的優(yōu)化等措施都有相應(yīng)例子實(shí)現(xiàn)蛋白產(chǎn)量的提高 。
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