原核表達(dá)載體-資料下載頁
2025-08-05 03:30本頁面
【正文】 50 μl 50 μl 50 μlTEMED 5 μl 7 μl 2 μl 7 μlTotal mL 5 mL 5 mL 5 mL在實驗中，試用了不同濃度的下層膠，以獲得最佳分離效果。 ②IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)（這個不確定）i. 將重組菌在含對應(yīng)抗生素的LB平板上劃線培養(yǎng)過夜。ii. 次日，挑取單克隆，接種到5 mL含對應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。iii. 將過夜培養(yǎng)的菌液100 μl加入到10 mL LB培養(yǎng)基中(1: 100)，200 r/min振蕩培養(yǎng)3 h左右至OD600=。iv. 培養(yǎng)完畢后，取1 mL菌液12000 rpm離心，棄上清，200 μl PBS懸浮。在剩余9 mL菌液中加100 mmol/L IPTG 54 mmol/L，此時記為0 h。v. 此后分別在1 h，2 h，3 h，4 h，5 h，6 h，9 h各取1 mL菌液，12000 rpm離心，棄上清，200 μl PBS重懸。加2Loading buffer后沸水變性5 min。vi. SDSPAGE檢測蛋白表達(dá)。 ③檢測重組蛋白可溶性（好像做多克隆抗體不用檢測蛋白可溶性？） i. 將重組菌在含對應(yīng)抗生素的LB平板上劃線培養(yǎng)過夜。ii. 次日，挑取單克隆，接種到5 mL含對應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。iii. 將過夜培養(yǎng)的菌液100 μl加入到10 mL LB培養(yǎng)基中(1: 100)，200 r/min振蕩培養(yǎng)3 h左右至OD600=。iv. 加入IPTG誘導(dǎo)至6 h，4℃，10000 g離心5 min。v. 去上清，PBS清洗沉淀。vi. 。vii. 收集沉淀，加適量破碎液重懸細(xì)胞，300 w超聲波破碎20 min，工作10 s停10 s。viii. 4℃，10000 g離心10 min。分離上清和沉淀，上清直接加等體積2 Loading buffer，沉淀用PBS重懸后，加等體積2Loading buffer，沸水煮5 min變性。ix. SDSPAGE檢測蛋白可溶性。 ④Western blot分析（還沒教） ⑤重組蛋白的親和
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