原核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略-資料下載頁
2025-03-04 13:36本頁面
【正文】 聚 合傾向的中間體的濃度； （ 4）選擇中等強度或低強度的啟動子代替強啟動子，降低重組蛋白的合 成速度； （ 5）選擇適合的宿主菌株； （ 6）表達(dá)含可溶性多肽或信號肽的重組蛋白，提高可溶性； （ 7）蛋白質(zhì)的可溶性往往與自身的氨基酸序列有關(guān)，因此可利用誘突 技術(shù)改變其氨基酸序列，提高目的蛋白的可溶性； （ 8）誘導(dǎo)過程中加入化學(xué)物質(zhì)，以增加滲透壓或改變培養(yǎng)基的 pH值。 原核表達(dá)常見的幾個問題及回答（ 2） ? 必須去除融合多肽或蛋白質(zhì)標(biāo)簽才能使目的蛋白獲得活性嗎？ ? 回答：大多數(shù)情況下目的蛋白帶有 His Tag,STag,11個氨基酸的 T7Tag或 HSVTag等小肽時仍能表現(xiàn)出完全的活性。這些肽段都較為親水，理論上都不會干擾蛋白的三維結(jié)構(gòu)。我們建議首先測試蛋白活性，再看是否一定要去除前導(dǎo)序列才能適合特定的應(yīng)用要求。 原核表達(dá)常見的幾個問題及回答（ 3） ? 如果目的蛋白包含信號序列，它會不會被運至細(xì)胞周質(zhì)并以可溶、活性形式存在？還是目的蛋白甚至可以被分泌到生長培養(yǎng)基中？ ? 回答：如果目的蛋白包含 ompT或 pelB這樣的前導(dǎo)序列，理論上它應(yīng)該被運至細(xì)胞周質(zhì)并以可溶、活性形式存在。如果在生長培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)目的蛋白的話，多半是因為細(xì)胞壁受到破壞，而并不代表蛋白是被分泌到培養(yǎng)基中的。除了信號肽對蛋白質(zhì)的運輸有影響，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的成熟區(qū)對蛋白質(zhì)的運轉(zhuǎn)也有影響。因此在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞周質(zhì)及其它區(qū)域發(fā)現(xiàn)目的蛋白都很正常。某些情況下降低誘導(dǎo)時的培養(yǎng)溫度至 2530 ℃ ，可能提高蛋白運輸?shù)谋壤? 原核表達(dá)常見的幾個問題及回答（ 4） ? IPTG誘導(dǎo)后細(xì)胞停止了生長，是不是表示細(xì)胞死了？ ? 回答： T7RNA聚合酶非?；钴S， T7轉(zhuǎn)錄和翻譯信號極強，因此，一旦誘導(dǎo)， 細(xì)胞的主要生理活動都向著目的蛋白表達(dá)的方面轉(zhuǎn)化 。在通常情況下，細(xì)胞將停止生長，形成克隆的能力大大降低，但并未死亡。菌落形成試驗可以用來檢測表達(dá)系統(tǒng)的性能。 但也有一些例外情況，例如特別的目的基因以及一些極為嚴(yán)緊的載體 /宿主菌組合 (比如含有 plysE的宿主菌 )等，這時在誘導(dǎo)后菌落還是會繼續(xù)生長。 原核表達(dá)常見的幾個問題及回答（ 5） ? 除了毒性和降解，還有些什么因素會影響目的蛋白的表達(dá)水平？ ? 回答： ? （ 1） mRNA轉(zhuǎn)錄子中的二級結(jié)構(gòu)會干擾 AUG翻譯起始密碼子和 /或核糖體結(jié)合位點。所有 pET載體的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物都是下列兩種之一： ? Rbs NdeI/NcoI ? 5’…AAGAAGGAGAUAUACAUAUG…3’ ? 5’…AAGAAGGAGAUAUACCAUGG…3’ ? 如果發(fā)現(xiàn)表達(dá)很差，你可以通過檢查編碼插入序列的鏈上的與上述序列互補的序列： ? 5‘CATATGTATATCTCCTTCTT3’或 ? 5’CCATGGTATATCTCCTTCTT3‘ ? 以確定是否因為存在潛在的二級結(jié)構(gòu)造成麻煩。 原核表達(dá)常見的幾個問題及回答（ 5） ? （ 2）目的基因中稀有密碼子比較多也是常見的表達(dá)水平低的原因。 如果稀有密碼子集中出現(xiàn)在氨基端情況更為嚴(yán)重。 應(yīng)該注意，根據(jù)現(xiàn)有對大腸桿菌高表達(dá)的基因研究發(fā)現(xiàn)的有限的稀有密碼子，已經(jīng)觀察到由于其對應(yīng)的 tRNAs水平很低，直接導(dǎo)致了翻譯延伸的困難。 ? （ 3） 序列中的意外的終止密碼子可能造成突變，這在 PCR克隆產(chǎn)物的情況下較為突出。 可以通過測序發(fā)現(xiàn)此類問題，也可以用體外翻譯的方法確認(rèn)重組子的表達(dá)能力。 原核表達(dá)常見的幾個問題及回答（ 6） ? 有時除了全長的目的蛋白以外，還能看到截短的產(chǎn)物，這時怎么回事？ ? 回答： 一個最直接原因就是蛋白水解了。然而第二點翻譯起始也非常有可能。 起始密碼子 AUG（ Met）的上游在 RNA編碼區(qū)有類似于核糖體結(jié)合位點序列（ AAGGAGG）的間隔序列（通常是 513個核苷酸）時，容易出現(xiàn)這種問題。截短蛋白在純化全長蛋白的操作時往往造成麻煩。 解決途徑之一即是選用兩端都帶有融合標(biāo)簽的 pET載體 ，例如 pET28和pET30序列載體。這樣，全長蛋白就可以通過提高咪唑濃度，在洗脫時將截短蛋白與全長蛋白區(qū)分開。另外 pET29和pET30系列載體在 N端融合有 STag，而 C端有 HisTag，因此可以先后用固定化 S蛋白和 His Binding樹脂親和純化以獲取全長蛋白。 重組質(zhì)粒和菌株的保存建議 ? 在實驗室里保存重組菌株的時候，為了挑菌和傳代方便，我們常用 LB平板保存在 4℃ 冰箱中，需要提質(zhì)粒和表達(dá)接種的時候，就直接從平板上挑菌，但是這種方法對于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性不利，容易出現(xiàn)質(zhì)粒丟失、表達(dá)水平不穩(wěn)定、菌株退化乃至發(fā)生污染等情況。 我們建議： 長期存放菌株和 pET重組子應(yīng)該在菌液中加入甘油并放置于－ 70℃ 保種。但是要注意高濃度甘油 ( 10%)會導(dǎo)致質(zhì)粒不穩(wěn)定。請盡量保持甘油濃度為 8％左右。（ 15%濃度的甘油保種液和新鮮菌液 1:1就行） 重組質(zhì)粒不宜長期保存于表達(dá)菌株（帶 DE3的大腸桿菌）中，請盡量使用帶有 recA endA突變的克隆菌株（比如 C600， DH5a）進(jìn)行質(zhì)粒抽提和保存質(zhì)粒。表達(dá)型的菌株提質(zhì)粒經(jīng)常會有質(zhì)量不高或者背景的問題。特別是在大量抽提過程中。
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