原核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略(已改無(wú)錯(cuò)字)
2023-03-23 13:36:45 本頁(yè)面
【正文】 and pLysS Novagen公司的PET32a表達(dá)載體圖譜 Novagen公司的 pET表達(dá)載體選擇 ? 從開(kāi)始涉及表達(dá)的時(shí)候可以根據(jù)是否要用基因本身的起始密碼子進(jìn)行選擇，Novagen公司僅提供三個(gè)載體： pET21(+)， pET24(+)和 pET23(+)。如果你打算利用載體的起始密碼子，那么就有許多選擇。 ? 根據(jù)是否要可溶性表達(dá)，選擇加有不同標(biāo)記的載體。一般說(shuō)來(lái)在大腸桿菌中不加標(biāo)記外源蛋白都會(huì)以不溶的包涵體形式表達(dá)。為了讓外源蛋白融合表達(dá)一般說(shuō)來(lái)有三個(gè)策略： ? 1. 與一個(gè)高度可溶的多肽聯(lián)合一起表達(dá)，比如：谷胱甘肽 S轉(zhuǎn)移酶（ glutathione Stransferase, GST）、硫氧還蛋白（ thioredoxin, Trx）和 N利用底物 A蛋白（ N utilization substance A, NusA）。 ? 2. 轉(zhuǎn)入一個(gè)酶催化二硫鍵的形成，如：硫氧還蛋白， DsbA， DsbC。 ? 3. 插入一個(gè)定位到周質(zhì)空間的信號(hào)肽序列。 ? 以上載體都是采用抗生素抗性篩選，如果你希望用藍(lán)白斑篩選可以使用 pETBlue系列載體。 ? 在重組技術(shù)上， Novagen除了傳統(tǒng)的酶切、連接方式外，還有不需要連接的克隆方式 ： LigationIndependent cloning，簡(jiǎn)稱(chēng) LIC。采用 LIC方法的 pET載體是線性化的，在末端有 1215個(gè)突出的堿基以在退火時(shí)和目的片斷互補(bǔ)。在設(shè)計(jì) PCR擴(kuò)增引物時(shí)加入與 LIC載體互補(bǔ)的序列， PCR產(chǎn)物用 3’→5’的內(nèi)切酶消化出單鏈與載體互補(bǔ)的序列。通過(guò)這種方式就可以把目的片斷定向、高效地插入 LIC載體上。 Novagen公司的大腸桿菌菌株選擇 ? Novagen提供多種表達(dá)使用的菌株，為了提高表達(dá)量做出了各種改造，它們大致分為以下幾個(gè)種類(lèi)： ? 1. 蛋白酶缺陷型 ? 所有 B菌株的衍生株都是 lon蛋白酶和 ompT蛋白酶缺陷型的 ，這包括有 B834, BL21, BLR,Origami? B, Rosetta?和 Tuner?。因此在純化時(shí)可以保持蛋白的穩(wěn)定不被降解。 BL21(DE3)是應(yīng)用最多的表達(dá)的表達(dá)菌株 。另外它的衍生株 BLR(DE3)是 recA－， RecA是大腸桿菌中介導(dǎo)同源重組的重要蛋白之一。它的缺失，可以保證質(zhì)粒的穩(wěn)定。 ? 2. 保證所有細(xì)胞以同樣量進(jìn)行表達(dá) ? Tuner?株及它的衍生株（ Origami? B和 Rosetta?）是 BL21菌株的 lacY1缺失突變型， 在這些菌株中可以使蛋白以同樣水平在所有細(xì)胞中表達(dá)。Lac滲透酶的突變使進(jìn)入每個(gè)細(xì)胞的 IPTG量都是一致的，這樣使蛋白表達(dá)濃度可以隨著 IPTG濃度而改變。 通過(guò)對(duì) IPTG濃度的控制可以使細(xì)胞微量表達(dá)或者大量表達(dá)。 一般說(shuō)來(lái)，低濃度表達(dá)有利于蛋白的可溶性和活性。 Novagen公司的大腸桿菌菌株選擇 ? 3. 二硫鍵形成與溶解性增強(qiáng) ? 二硫鍵的形成對(duì)某些蛋白的可溶性起到重要的作用，而 Novagen也專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)了一些菌株是谷胱甘肽還原酶（ gor）和 /或硫氧還蛋白還原酶（ trxB）缺陷型的，包括 AD494， BL21trxB， Origami， Origami B和 Rosettagami?。在這些菌株中表達(dá)蛋白， 可以更大程度促進(jìn)二硫鍵的形成，并使蛋白以可溶形式和有活性形式出現(xiàn)的可能增加。 ? 4. 稀有密碼子的補(bǔ)給 ? 不同物種有不同的密碼子偏愛(ài)性，如果外源蛋白中含大量大腸桿菌的稀有密碼子，特別當(dāng)這些稀有密碼子呈連續(xù)分布的時(shí)候，就會(huì)造成蛋白表達(dá)量極低，或者翻譯提前終止。 Rosetta?是為了表達(dá)真核蛋白而特別設(shè)計(jì)的，它含有大腸桿菌稀有的密碼子 tRNA，包括 AUA， AGG， AGA， CUA， CCC和 GGA。它們以氯霉素抗性的質(zhì)粒形式存在。 Rosetta系列是來(lái)自 BL21lacY1，所以它具有BL21lacY1的所有特性。 ? 5. 硒蛋氨酸標(biāo)記 ? B834是來(lái)源于 BL21的蛋氨酸（ met）營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。它在高度特異活性35Smet標(biāo)記和晶體成像蛋氨酸標(biāo)記中非常有用。 原核表達(dá)需要考慮的問(wèn)題 ? 在原核蛋白表達(dá)過(guò)程中，選擇構(gòu)建一個(gè)合適原核表達(dá)體系需要綜合考慮 3大因素： 表達(dá)載體、宿主菌株、表達(dá)誘導(dǎo)條件 ,以獲得最滿(mǎn)意的表達(dá)效果。 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的高效表達(dá)策略 ? 采用高強(qiáng)度啟動(dòng)子 如 T7啟動(dòng)子； ? 將目的基因所有密碼子都換成大腸桿菌 ? 偏好的密碼子（需要重新合成基因）， ? 或采用含有大腸桿菌稀有密碼子 tRNA ? 的 Rosetta系列菌株。 ? 采用豐富培養(yǎng)基（如 TB）代替普通的 LB培養(yǎng) ? 基； ? 優(yōu)化大腸桿菌的生長(zhǎng)條件和目的基因的誘導(dǎo)表 ? 達(dá)條件。 使用 pET表達(dá)系統(tǒng)的常見(jiàn)問(wèn)題分析 幾個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題如下表： 原核表達(dá)常見(jiàn)的幾個(gè)問(wèn)題及回答（ 1） ? 目的蛋白總是以不可溶的形式出現(xiàn)。 ? 解決辦法：采用以下八種策略提高目的蛋白的可溶性。 提高大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)重組蛋白可溶性的策略 大致有八種策略： （ 1）在細(xì)胞中表達(dá)分子伴侶（天然或異源），輔助新生肽鏈折疊，避免 肽鏈相互聚合； （ 2）共表達(dá)折疊酶，催化共價(jià)鍵形成； （ 3）通過(guò)降低培養(yǎng)溫度和搖床速度來(lái)降低蛋白合成速度，以降低有
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