原核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略-展示頁
2025-03-10 13:36本頁面
【正文】 及功能研究的開展 , 對(duì)基因表達(dá)的要求更高 , ? 這時(shí)大腸桿菌往往是表達(dá)的第一選擇 。 原核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn) ? 細(xì)菌培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)繁殖快、價(jià)格 低廉； ? 外源基因表達(dá)產(chǎn)物的水平高 ( 如大腸桿菌中目的蛋白的表達(dá)量可超過細(xì)菌總蛋白量的 80%) ； ? 基因背景和表達(dá)特性清楚。微生物基因工程 李剛 副教授 教學(xué)內(nèi)容 ? 一、 PCR引物的設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)操作技巧； 二、基因組文庫的建立與篩選； 三、定向進(jìn)化技術(shù)在微生物酶制劑研究中 ? 的應(yīng)用； 四、原核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略； ? 五、真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略。 四、原核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略 原核生物表達(dá)系統(tǒng)主要包括： 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng) 、 枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng) 、鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng) 等 , 其中應(yīng)用最廣泛的是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng) ? 自 20 世紀(jì) 70 年代以來 , 大腸桿菌一直是基因工程中應(yīng)用最為廣泛的表達(dá)系統(tǒng)。 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn) ? 優(yōu)點(diǎn)： ? 大腸桿菌具有培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)繁殖快、安全性好、 ? 可以高效表達(dá)不同外源基因產(chǎn)物等特點(diǎn) , 是許多外源基因 ? 表達(dá)系統(tǒng)中最好的一種 , 是目前研究最深入、發(fā)展也最完善的表達(dá)系統(tǒng) , 大量的有價(jià)值的多肽和蛋白質(zhì)已在大腸桿菌中獲得了超量表達(dá)。②不能進(jìn)行翻譯后的加工修飾 , 如糖基化、磷酸化及?；?。 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的基本概念 ? 首先講述一些大腸桿菌表達(dá)的基本概念： 一個(gè)完整的表達(dá)系統(tǒng)通常包括配套的表達(dá)載體和表達(dá)菌株 ，如果是特殊的誘導(dǎo)表達(dá)還包括誘導(dǎo)劑，如果是融合表達(dá)還包括純化系統(tǒng)或者 Tag檢測(cè)等等。 主要?dú)w結(jié)在表達(dá)載體的選擇上 。通常，載體很貴，我們可以通過實(shí)驗(yàn)室之間交換得到免費(fèi)的載體。 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的基本概念 ? 復(fù)制子： 通常表達(dá)載體都會(huì)選用高拷貝的復(fù)制子。 通常情況下質(zhì)?？截悢?shù)和表達(dá)量是非線性的正相關(guān) ，當(dāng)然也不是越多越好，超過細(xì)胞的承受范圍反而會(huì)損害細(xì)胞的生長(zhǎng)。 篩選標(biāo)記和報(bào)告基因： 氨芐青霉素抗性是最常見的篩選標(biāo)記 ，卡那霉素或者是新霉素次之，四環(huán)素，紅霉素和氯霉素等已經(jīng)日漸式微。 在表達(dá)篩選中要注意的問題應(yīng)該就是 LB倒板前加抗生素的溫度，溫度過高容易導(dǎo)致抗生素失效。 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的基本概念 ? 對(duì)于做表達(dá)來說，如果不是要研究啟動(dòng)子的強(qiáng)弱，通常比較少關(guān)心或者用到報(bào)告基因吧。一些融合表達(dá) Tag也有報(bào)告基因的功能。 從轉(zhuǎn)錄模式上看有組成型表達(dá)和誘導(dǎo)調(diào)控型表達(dá)。 ? 轉(zhuǎn)錄終止子對(duì)外源基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)有重要作用 ——控制轉(zhuǎn)錄的 RNA長(zhǎng)度提高穩(wěn)定性，避免質(zhì)粒上異常表達(dá)導(dǎo)致質(zhì)粒穩(wěn)定性下降。轉(zhuǎn)錄終止子有兩類，分別是 Rho因子作用下使 mRNA轉(zhuǎn)錄終止的終止子和根據(jù)模版上的對(duì)稱序列形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)而終止 mRNA轉(zhuǎn)錄的終止子。 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的基本概念 ? 核糖體結(jié)合位點(diǎn)：?jiǎn)?dòng)子下游從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)開始延伸的一段堿基序列， 其中能與rRNA16S亞基 339。 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的幾種表達(dá)方式 ? 組成型表達(dá)： 表達(dá)載體的啟動(dòng)子為組成型啟動(dòng)子，也就是一直努力不停表達(dá)目的蛋白的啟動(dòng)子，如pMAL系統(tǒng)。 因?yàn)檫^量或者有害的表達(dá)產(chǎn)物會(huì)影響細(xì)菌的生長(zhǎng)，反過來影響表達(dá)量的積累。這種方法有助于避免菌體生長(zhǎng)前期高表達(dá)對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響，又可減少菌體蛋白酶對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的降解。 另外也有啟動(dòng)子是組成型的，但是啟動(dòng)子所依賴的轉(zhuǎn)錄酶是誘導(dǎo)表達(dá)的，也屬于誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。 對(duì)于特別小的分子建議用較大的 Tag（如 GST）以獲得穩(wěn)定表達(dá)；而一般的基因多選擇小 Tag以減少對(duì)目的蛋白的影響。 ? 分泌表達(dá)： 在起始密碼和目的基因之間加入信號(hào)肽，可以引導(dǎo)目的蛋白穿越細(xì)胞膜，避免表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的過度累積而影響細(xì)胞生長(zhǎng)，或者形成包涵體，而且表達(dá)產(chǎn)物通常是可溶的活性狀態(tài)，不需要復(fù)性。 ? 可溶性表達(dá) ： 大腸桿菌表達(dá)效率很高，特別是強(qiáng)啟動(dòng)子，目的蛋白來不及折疊而形成不溶的包涵體顆粒 ， 包涵體容易純化但是復(fù)性效率不高。 提高大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)重組蛋白可溶性的策略 大致有八種策略： （ 1）在細(xì)胞中表達(dá)分子伴侶（天然或異源），輔助新生 肽鏈折疊，避免肽鏈相互聚合（例如 Takara的 Chaperone plasmid Set）； （ 2）共表達(dá)折疊酶，催化共價(jià)鍵形成； （ 3）通過降低培養(yǎng)溫度和搖床速度來降低蛋白合成速度，以降低有聚 合傾向的中間體的濃度； （ 4）選擇中等強(qiáng)度或低強(qiáng)度的啟動(dòng)子代替強(qiáng)啟動(dòng)子，降低重組蛋白的合 成速度； （ 5）選擇適合的宿主菌株； （ 6）表達(dá)含可溶性多肽或信號(hào)肽的重組蛋白，提高可溶性； （ 7）蛋白質(zhì)的可溶性往往與自身的氨基酸序列有關(guān)，因此可利用誘突 技術(shù)改變其氨基酸序列，提高目的蛋白的可溶性； （ 8）誘導(dǎo)過程中加入化學(xué)物質(zhì)，以增加滲透壓或改變培養(yǎng)基的 pH值。其轉(zhuǎn)錄受 CAP正調(diào)控和 lacI負(fù)調(diào)控。 lacI產(chǎn)物是一種阻遏蛋白，能結(jié)合在操縱基因 lacO 上從而阻遏轉(zhuǎn)錄起始。這種可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控成為了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)載體構(gòu)建的常用元件。 ? trc啟動(dòng)子 是 trp啟動(dòng)子和 lac啟動(dòng)子的拼合啟動(dòng)子，
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1