原核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略-文庫吧資料
2025-03-08 13:36本頁面
【正文】 GEX系列 Invitrogen Champion? pET Expression System等四個系列 ? 比起其它公司的原核表達(dá)系列來說 Invitrogen有個非常突出的地方就是它的重組克隆技術(shù)。由于大腸桿菌本身不含 T7 RNA 聚合酶，需要將外源的 T7 RNA 聚合酶引入宿主菌，因而 T7 RNA 聚合酶的調(diào)控模式就決定了 T7系統(tǒng)的調(diào)控模式 ——非誘導(dǎo)條件下，可以使目的基因完全處于沉默狀態(tài)而不轉(zhuǎn)錄，從而避免目的基因毒性對宿主細(xì)胞以及質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響；通過控制誘導(dǎo)條件控制T7 RNA 聚合酶的量，就可以控制產(chǎn)物表達(dá)量，某些情況下可以提高產(chǎn)物的可溶性部分。 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中幾個常用的啟動子 ? T7啟動子是當(dāng)今大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的主流 ， 這個功能強(qiáng)大兼專一性高的啟動子經(jīng)過巧妙的設(shè)計而成為原核表達(dá)的首選，尤其以 Novagen公司的 pET系統(tǒng)為杰出代表。 另外一種思路是通過嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控 cI產(chǎn)物來間接調(diào)控 PL、 PR啟動子的轉(zhuǎn)錄。同樣也是 30度下阻遏啟動子轉(zhuǎn)錄， 42度下解除抑制開發(fā)轉(zhuǎn)錄。這兩個強(qiáng)啟動子受控于 λ噬菌體 cI基因產(chǎn)物。 熱誘導(dǎo)不用添加外來的誘導(dǎo)物，成本低，但是由于發(fā)酵過程中加熱升溫比較慢而影響誘導(dǎo)效果，而且 熱誘導(dǎo)本身會導(dǎo)致大腸桿菌的熱休克蛋白激活，一些蛋白酶會影響產(chǎn)物穩(wěn)定。 IPTG廣泛用于誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，但是 IPTG有一定毒性，有人認(rèn)為在制備醫(yī)療目的的重組蛋白并不合適，因而也有用乳糖代替 IPTG作為誘導(dǎo)物的研究。 在常規(guī)的大腸桿菌中， lacI阻遏蛋白表達(dá)量不高，僅能滿足細(xì)胞自身的 lac操縱子，無法應(yīng)付多拷貝的質(zhì)粒的需求，導(dǎo)致非誘導(dǎo)條件下較高的本底表達(dá)，為了讓表達(dá)系統(tǒng)嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控產(chǎn)物表達(dá)， 能過量表達(dá) lacI阻遏蛋白的 lacIq突變菌株常被選為 Lac/Tac/trc表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)菌株 。 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中幾個常用的啟動子 ? tac啟動子 是 trp啟動子和 lacUV5的拼接雜合啟動子，且 轉(zhuǎn)錄水平更高 ，比 lacUV5更優(yōu)越。乳糖的類似物 IPTG可以和 lacI產(chǎn)物結(jié)合，使其構(gòu)象改變離開 lacO，從而激活轉(zhuǎn)錄。 ? lacUV5突變能夠在沒有 CAP的存在下更有效地起始轉(zhuǎn)錄，該啟動子在轉(zhuǎn)錄水平上只受 lacI的調(diào)控，因而隨后得到了更廣泛采用。 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中幾個常用的啟動子 ? 最早應(yīng)用于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的是 Lac乳糖操縱子 ，由 啟動子 Plac、操縱基因 lacO和結(jié)構(gòu)基因組成。分泌表達(dá)可以得到可溶的產(chǎn)物，也有部分融合 Tag有助于提高產(chǎn)物的可溶性 ，比如 Thio， pMAL系統(tǒng)。通常這種分泌只是分泌到細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間的 周質(zhì)空間 。 HisTag是最廣泛采用的 Tag。 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的幾種表達(dá)方式 ? 融合表達(dá) ： 表達(dá)載體的多克隆位點上有一段融合表達(dá)標(biāo)簽（ Tag），表達(dá)產(chǎn)物為融合蛋白（有分 N端或者 C端融合表達(dá)），方便后繼的純化步驟或者檢測。特別適合解決有毒蛋白的表達(dá)。 ? 誘導(dǎo)調(diào)控型表達(dá)： 表達(dá)載體采用誘導(dǎo)型啟動子，只有在誘導(dǎo)劑存在的條件下才能表達(dá)目的產(chǎn)物。 持續(xù)性表達(dá)通常表達(dá)量比較高，成本低，但是不適合表達(dá)一些對宿主細(xì)菌生長有害的蛋白。端互補(bǔ)的 SD序列對形成翻譯起始復(fù)合物是必需的 ，多數(shù)載體啟動子下游都有 SD序列，也有些載體沒有，適合自帶 SD序列的基因表達(dá)，要留意。常見的是 rrnB 、 rRNA操縱子的 T1T2串連轉(zhuǎn)錄終止子。放在啟動子上游的轉(zhuǎn)錄終止子還可以防止其他啟動子的通讀，降低本底。 lac和 Tac， PL和 PR， T7是最常用的啟動子。 啟動子、終止子和核糖體結(jié)合位點： 啟動子： 啟動子的強(qiáng)弱是對表達(dá)量有決定性影響的因素之一 。 綠色熒光蛋白是最常用的報告基因了 （注意選擇適用原核表達(dá)版本的 GFP），其他還有 半乳糖苷酶 ， 熒光素酶 等等。 今天耐青霉素的超級細(xì)菌泛濫，不知道是否有我們實驗人員的功勞呢？ 大家“隨便倒掉”已經(jīng)獲得氨芐抗性的大腸桿菌之前有沒有經(jīng)過煮沸或者消毒等處理呢？ 從以前的一針 50萬單位到現(xiàn)在 100多萬個單位，青霉素劑量似乎越來越大了。抗性基因的選擇要注意是否會對研究對象產(chǎn)生干擾，比如代謝研究中要留意抗性基因編碼的酶是否和代謝物相互作用。 如果碰巧需要 2個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化，就要考慮復(fù)制元是否相容的問題。 pSC101類質(zhì)粒是嚴(yán)謹(jǐn)方式復(fù)制，拷貝數(shù)低， pCoE1， pMBI(pUC)類的復(fù)制子的拷貝數(shù)高達(dá)500以上，是表達(dá)載體常用的。但是要小心，輾轉(zhuǎn)多個實驗室和多個實驗室成員之手的載體是否保持原來的遺傳背景 ？ MCS是否還是原來那個 MCS？是我們要特別注意的。 ? 表達(dá)載體 ：我們關(guān)心的質(zhì)粒上的元件包括 啟動子 ，多克隆位點 ， 終止密碼 ， 融合 Tag（如果有的話），復(fù)制子， 篩選標(biāo)記 /報告基因 等。 選擇表達(dá)系統(tǒng)通常要根據(jù)實驗?zāi)康膩砜紤] ，比如表達(dá)量高低，目標(biāo)蛋白的活性，表達(dá)產(chǎn)物的純化方法等等。 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的操作流程 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)操作的一般程序如下： 獲得目的基因－準(zhǔn)備表達(dá)載體－將目的基因插入表達(dá)載體中 （ 測序驗證 ） －轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌－誘導(dǎo)靶蛋白的表達(dá)－表達(dá)蛋白的分析－擴(kuò)增 、 純化 、 進(jìn)一步檢測 。 ? 缺點： ? 大腸桿菌表達(dá)體系與其他表達(dá)體系相比 , 也具有一些缺 ? 點 : ① 高效表達(dá)易形成包涵體。尤其是進(jìn)入后基因組時代以來 , 有關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)以
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