原核表達(dá)載體-全文預(yù)覽
【正文】 TG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)（這個(gè)不確定）i. 將重組菌在含對(duì)應(yīng)抗生素的LB平板上劃線(xiàn)培養(yǎng)過(guò)夜。 酶切反應(yīng)體系、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間根據(jù)內(nèi)切酶的種類(lèi)確定設(shè)計(jì)。離心管中的液體即為回收的目的基因片段，可立即使用或保存于20℃?zhèn)溆?。iv. 取下吸附柱，倒掉收集管中的廢液，加入600 μl Wash solution，室溫12000 rpm離心30 s。%瓊脂糖凝膠分離。 Ⅸ. 菌種保存取500μl重組菌液加入等體積50%的無(wú)菌甘油(終濃度達(dá)到25%)，液氮速凍，80℃保存。可立即使用或保存于20℃?zhèn)溆?。⑧重?fù)步驟⑦一次。④加入250 μl SolutionⅡ，輕柔顛倒離心管46次。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同上面獲取目的基因的PCR一樣。 ④棄去上清，加入4 mL預(yù)冷的含15% mol/L的CaCl2 溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置幾分鐘，即成感受態(tài)細(xì)胞懸液。Ⅱ. 目的片斷與克隆載體pMD18T連接： pMD 19T Simple Vector（T載體，小紙盒子中） 1ulInsert DNA 2ul 5ul dH2O 2ulSolution I（冰中融化，小紙盒子中，跟T載體一起） 5ul（等量）16℃反應(yīng)30minⅢ. E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備：①將E. coli DH5α在LB平板上劃線(xiàn)培養(yǎng)過(guò)夜。⑤重復(fù)步驟④一次。（2）克隆載體的構(gòu)建：Ⅰ. 目的基因的切膠回收：①在紫外燈下迅速用干凈的手術(shù)刀切下含目的基因的瓊脂糖凝膠塊，放入已稱(chēng)重的離心管中，在保證目的基因全部回收的同時(shí)，應(yīng)盡量減少膠的體積。原核表達(dá)載體（pET30c ？）。宿主菌DH5α。 先設(shè)計(jì)好PCR的引物和PCR的反應(yīng)程序。④取下吸附柱，倒掉收集管中的廢液，加入600 μl Wash solution，室溫12000 rpm離心30 s。離心管中的液體即為回收的目的基因片段，可立即使用或保存于20℃?zhèn)溆?。③棄去上清?mol/L的無(wú)菌CaCl2 溶液10 mL輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置20 min，4℃下3000 rpm離心10 min。Ⅴ. 挑取白色單克隆菌落，重懸于5 μl ddH2O中，取其中1 μl用于PCR鑒定。③棄上清，加入250 μl Solution I，重懸菌體細(xì)胞。⑦取下吸附柱，倒掉收集管中的廢液，加入500 μl Wash S
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