原核表達載體-文庫吧
2025-07-21 03:30 本頁面
【正文】 mL LB培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。②將過夜培養(yǎng)的菌液1 mL加入到100 mL LB培養(yǎng)基中(1: 100)，培養(yǎng)23 h至OD600=，轉入預冷的無菌離心管中，冰上放置10 min，然后于4℃下3000 rpm離心10 min。③棄去上清， mol/L的無菌CaCl2 溶液10 mL輕輕懸浮細胞，冰上放置20 min，4℃下3000 rpm離心10 min。 ④棄去上清，加入4 mL預冷的含15% mol/L的CaCl2 溶液，輕輕懸浮細胞，冰上放置幾分鐘，即成感受態(tài)細胞懸液。⑤感受態(tài)細胞分裝成100 μl的小份，于冰上備用，或液氮速凍貯存于80℃。Ⅳ. 重組質(zhì)粒轉化E. coli DH5α（熱擊法） DH52（200ul）或（100ul） 【非連接載體加2ul】 【加入后離火遠點輕輕用手撥】↓冰上放置20min ↓42℃水浴熱擊90s ↓立即放置冰上2min（勿震蕩） ↓于超凈工作臺加800ul LB培養(yǎng)液 ↓37℃，150rpm預培養(yǎng)50min ↓6000rpm離心1min，吸除800ul上清；剩余液體用來懸浮沉淀 ↓涂布LB+Amp平板上，37℃倒置培養(yǎng)12h（于超凈工作臺吹干液體）。Ⅴ. 挑取白色單克隆菌落，重懸于5 μl ddH2O中，取其中1 μl用于PCR鑒定。PCR反應體系和反應程序同上面獲取目的基因的PCR一樣。Ⅵ. 重組質(zhì)粒的提?。═IANGEN質(zhì)粒小提試劑盒，方法可以看試劑盒說明書） ①將以上剩余的4 μl菌液接種到5 mL含Amp抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。②取3 mL菌液，室溫12000 rpm離心1 min。③棄上清，加入250 μl Solution I，重懸菌體細胞。④加入250 μl SolutionⅡ，輕柔顛倒離心管46次。⑤加入350 μl SolutionⅢ，輕柔顛倒離心管68次，此時應出現(xiàn)白色絮狀沉淀，室溫12000 rpm離心10 min。⑥取上清（注意不要吸到蛋白），轉入吸附柱，室溫放置1 min，12000 rpm離心1 min。⑦取下吸附柱，倒掉收集管中的廢液，加入500 μl Wash Solution，室溫12000 r
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