原核表達(dá)載體(更新版)
【正文】 00 rpm離心1 min。⑩ mL滅菌離心管中，在柱膜中央加入60 μl 75℃預(yù)熱的ddH2O，室溫放置2 min，12000 rpm離心1 min。構(gòu)建克隆載體的方法參見上面步驟。vi. 取下吸附柱，倒掉收集管中的廢液，室溫12000 rpm離心1 min。⑧菌種保存取500μl重組菌液加入等體積50%的無菌甘油(終濃度達(dá)到25%)，液氮速凍，80℃保存。加2Loading buffer后沸水變性5 min。vii. 收集沉淀，加適量破碎液重懸細(xì)胞，300 w超聲波破碎20 min，工作10 s停10 s。分離上清和沉淀，上清直接加等體積2 Loading buffer，沉淀用PBS重懸后，加等體積2Loading buffer，沸水煮5 min變性。 ③檢測重組蛋白可溶性（好像做多克隆抗體不用檢測蛋白可溶性？） i. 將重組菌在含對應(yīng)抗生素的LB平板上劃線培養(yǎng)過夜。 ②IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)（這個(gè)不確定）i. 將重組菌在含對應(yīng)抗生素的LB平板上劃線培養(yǎng)過夜。離心管中的液體即為回收的目的基因片段，可立即使用或保存于20℃?zhèn)溆谩?瓊脂糖凝膠分離?？闪⒓词褂没虮４嬗?0℃?zhèn)溆?。④加?50 μl SolutionⅡ，輕柔顛倒離心管46次。 ④棄去上清，加入4 mL預(yù)冷的含15% mol/L的CaCl2 溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置幾分鐘，即成感受態(tài)細(xì)胞懸液。⑤重復(fù)步驟④一次。原核表達(dá)載體（pET30c ？）。 先設(shè)計(jì)好PCR的引物和PCR的反應(yīng)程序。離心管中的液體即為回收的目的基因片段，可立即使用或保存于20℃?zhèn)溆?。? 挑取白色單克隆菌落，重懸于5 μl ddH2O中，取其中1 μl用于PCR鑒定。⑦取下吸附柱，倒掉收集管中的廢液，加入500 μl Wash Solution，室溫12000 rpm離心1 min。 Ⅷ. 重組質(zhì)粒的目的基因的序列測定重組質(zhì)粒由測序公司測序。iii. 加入2倍體積solution DEB，顛倒混勻，將溶液轉(zhuǎn)移到吸附柱中，室溫放置1 min，12000 rpm離心1 min。 ⑥轉(zhuǎn)化菌的PCR鑒定（菌落PCR） ⑦轉(zhuǎn)化菌的酶切鑒定：轉(zhuǎn)化菌菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，雙酶切檢測。iv. 培養(yǎng)完畢后，取1 mL菌液12000 rpm離心，棄上清，200 μl PBS懸浮。iv. 加入IPTG誘導(dǎo)至6 h，4℃，10000 g離心5
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