【導(dǎo)讀】成團(tuán)塊,這種現(xiàn)象叫做凝集反應(yīng)?？乖谘逯?，使其充分混合，輕輕搖動(dòng)平板2分鐘，判定結(jié)果。現(xiàn)明顯的凝集塊，背景清亮即可判為陽性；介于二者之間判為可疑。本試驗(yàn)應(yīng)在22℃以上的環(huán)境中進(jìn)行，每次進(jìn)行反應(yīng)時(shí)應(yīng)有陽性血清和抗原對(duì)照。使用前將抗原充分搖。勻，每次檢測(cè)時(shí)作陽性、陰性血清及鹽水對(duì)照。染細(xì)菌或霉菌，出現(xiàn)自凝顆?；蛎箞F(tuán)時(shí)應(yīng)廢棄。一般在20秒鐘內(nèi)出現(xiàn)反應(yīng)，2分鐘判定結(jié)果。免疫擴(kuò)散試驗(yàn)又稱瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)。其原理是抗原抗體在含有電解質(zhì)的瓊脂凝。膠中可以向四周自由擴(kuò)散，當(dāng)抗原、抗體擴(kuò)散至適當(dāng)部位相遇時(shí)，則出現(xiàn)肉眼可見的沉淀線，這是抗原抗體的特異性結(jié)合物，可以用此試驗(yàn)測(cè)定未知的抗體或抗原。將孔中的瓊脂用6-8. 中心孔滴加抗原，1、4孔加入陽性血清。待孔中液體吸干后，將平皿倒置，放入37℃溫箱中，孔直伸或其向外側(cè)偏彎者，此受檢血清判為陰性?？字腥〕龊辽龡壢?。

　　

【正文】 號(hào)筆標(biāo)明與取水瓶編號(hào)相同的號(hào)碼。 1ml 消毒液加入上述 4 塊平皿內(nèi)。 。 分別澆于上述 4 塊平皿內(nèi) ,輕搖使其混勻。 37℃溫箱培養(yǎng) 2448 小時(shí)后 , 分別在營(yíng)養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、高鹽甘露醇瓊脂、霉菌培養(yǎng)基上計(jì)數(shù)總菌、大腸桿菌、葡萄球菌、霉菌數(shù)。 : 如總菌數(shù)超過 10 個(gè) , 或有致病菌的存在 , 則認(rèn)為其已無消毒作用，應(yīng)換以新配制的消毒液。 病毒和分子生物 病毒室負(fù)責(zé)禽病毒活毒疫苗的毒價(jià)檢測(cè)。現(xiàn)檢測(cè)的疫苗主要有： ND， IB， ND+IB， MD，IBD。檢測(cè)操作均為無菌操作。具體檢測(cè)方法如下。 一 、 ND 疫苗檢測(cè)程序 雞胚處理：取 911 日齡 SPF 的雞胚 27 枚，照蛋，標(biāo)記，消毒，打孔。 疫苗的復(fù)蘇：按疫苗的頭份數(shù)用稀釋液或 PBS 復(fù)蘇疫苗至使用濃度。 疫苗的稀釋：用含青霉素 G 鉀 100IU/ml，硫酸鏈霉素 100ug/ml 的 PBS 將使用濃度的疫苗作 10 倍系列稀釋 (101至 1010)。 接種：用稀釋度為 106至 1010的疫苗液經(jīng)尿囊腔接種雞胚，每個(gè)稀釋度接種 5 枚，每胚 。 照蛋和收獲：雞胚在 37℃條件下孵育 7 天，每天照蛋，棄去接種后 24 小時(shí)內(nèi)死亡的雞胚。收獲死亡胚，標(biāo)記日 期，存放于 4℃冰箱中。 判定結(jié)果：孵育 7 天后看結(jié)果。收獲尿囊液并做 HA 試驗(yàn)。 NDV 血凝價(jià)大于 1:8 的雞胚計(jì)為 NDV 感染胚。計(jì)算每個(gè)稀釋度的累計(jì)死亡數(shù) ,用 ReedMuench 法計(jì)算疫苗的毒價(jià)(EID50/Dose)。作出疫苗檢測(cè)報(bào)告。 二、 IB 疫苗檢測(cè)程序 雞胚處理：取 911 日齡 SPF 的雞胚 27 枚 ,照蛋 ,標(biāo)記，消毒，打孔。 疫苗的復(fù)蘇：按疫苗的頭份數(shù)用稀釋液或 PBS 復(fù)蘇疫苗至使用濃度。 疫苗的稀釋：用含青霉素 G 鉀 100IU/ml，硫酸鏈霉素 100ug/ml 的 PBS 將使用濃度的疫苗作 10 倍 系列稀釋 (101至 107)。 接種：用稀釋度為 103至 107的疫苗液經(jīng)尿囊腔接種雞胚 ,每個(gè)稀釋度接種 5 枚 ,每胚。 照蛋和收獲：雞胚在 37℃條件下孵育 7 天 ,每天照蛋 ,棄去接種后 24 小時(shí)內(nèi)死亡的雞胚 ,收獲死亡胚 ,標(biāo)記日期 ,存放于 4℃冰箱中。 判定結(jié)果：孵育 7 天后看結(jié)果。打開所有雞胚，觀察 IBV 引起的特征性病變，計(jì)算每個(gè)稀釋度的累計(jì)感染胚數(shù)。用 ReedMuench法計(jì)算疫苗的毒價(jià) (EID50/Dose)。作出疫苗檢測(cè)報(bào)告。 三、 ND+IB 二聯(lián)苗檢測(cè)程序 ND+IB 二聯(lián)苗的毒價(jià)測(cè) 定分為兩部分。其中單價(jià)苗 NDV 的毒價(jià)測(cè)定同常規(guī)的 ND 疫苗測(cè)定。 單價(jià)苗 IBV的毒價(jià)測(cè)定則必須首先把 NDV完全中和后再測(cè)定。測(cè)定程序如下： 按疫苗的頭份數(shù)用稀釋液或 PBS 復(fù)蘇疫苗至使用濃度。 中和 NDV：取 1ml 使用濃度的 ND+IB 二聯(lián)苗放入一滅菌試管內(nèi)，并加入 1 毫升抗NDV血清混勻，室溫下孵育 1 小時(shí)。 在滅菌試管內(nèi)，用含青霉素 G 鉀 100IU/ml，硫酸鏈霉素 100ug/ml 的 PBS 把病毒與血清的混合液作 10 倍系列稀釋 (101至 107)。 接種：用稀釋度為 103至 107的疫苗液經(jīng)尿囊腔 接種雞胚 ,每個(gè)稀釋度接種 5 枚 ,每胚。 照蛋和收獲：雞胚在 37℃條件下孵育 7 天。每天照蛋，棄去接種后 24 小時(shí)內(nèi)死亡的雞胚，收獲死亡胚，標(biāo)記日期，存放于 4℃冰箱中。 判定結(jié)果：孵育 7 天后看結(jié)果。收獲尿囊液并做 HA 試驗(yàn) ,如 NDV 血凝價(jià)大于 1:8，則該試驗(yàn)不成立。打開所有雞胚 ,觀察 IBV 引起的特征性病變。計(jì)算每個(gè)稀釋度的累計(jì)感染胚數(shù)。用 ReedMuench法計(jì)算疫苗的毒價(jià) (EID50/Dose)。作出疫苗檢測(cè)報(bào)告。 四、 MD 疫苗檢測(cè)程序 MD 疫苗的復(fù)蘇：準(zhǔn)備好一個(gè)盛有 37℃水的燒杯。將盛 MD 疫苗的安瓿自液氮罐中取出后，放入水中，使疫苗迅速于 60 秒內(nèi)融解。 MD 疫苗的稀釋：將復(fù)蘇后的疫苗用稀釋液至使?jié)舛?，再含青霉?G 鉀100IU/ml，硫酸鏈霉素 100ug/ml 的 PBS 把疫苗 10 倍系列稀釋 (101至 102)。 MD 疫苗接種：挑選生長(zhǎng)良好的 CEF 原代細(xì)胞 ,傾去營(yíng)養(yǎng)液 ,接種 病毒液。 101及 102稀釋度各接種 3 瓶，留 2 瓶細(xì)胞做對(duì)照。再將細(xì)胞放入 5%CO2,37℃的培養(yǎng)箱中吸附1 小時(shí)。傾去病毒液 ,向細(xì)胞瓶中加入含 2%犢牛血清的維持液，繼續(xù)培養(yǎng) 24 小時(shí)。 鋪營(yíng)養(yǎng)瓊脂 ：傾去細(xì)胞瓶中的維持液。加入含 1%瓊脂 ,5%犢牛血清的 199。培養(yǎng) 5天后觀察結(jié)果。 結(jié)果判定：計(jì)算每瓶的空斑數(shù)。按公式： PFU/dose= 平均每瓶空斑數(shù) X 稀釋倍數(shù) X 復(fù)蘇疫苗所用液體體積（ ml） 接種疫苗體積（ ml） X 疫苗頭份數(shù)（ dose） 計(jì)算 MD 疫苗的 PFU/dose。作出疫苗檢測(cè)報(bào)告。 五、 IBD 疫苗檢測(cè)程序（ PFU法） IBD 疫苗的復(fù)蘇和稀釋：用疫苗稀釋液復(fù)蘇疫苗到使用濃度。用含青霉素 G 鉀 100IU/ml，硫酸鏈霉素 100ug/ml 的 PBS 將疫苗再作 10 倍系列稀釋 (101至 109)。 疫苗接種：挑選生長(zhǎng)良好的 CEF 原代細(xì)胞 ,傾去營(yíng)養(yǎng)液 ,接種 病毒液。將 107，108及 109稀釋度各接種 3 瓶，留 2 瓶細(xì)胞做對(duì)照。放入 37℃的 CO2 培養(yǎng)箱中吸附 1 小時(shí)。 鋪第一層營(yíng)養(yǎng)瓊脂：傾去病毒液 ,加入含 1%瓊脂 ,5%犢牛血清的 199，培養(yǎng) 48 小時(shí)。 鋪第二層營(yíng)養(yǎng)瓊脂：向第一層瓊脂上再加入含 %中性紅 ,1%瓊脂 ,5%犢牛血清的199，繼續(xù)培養(yǎng) 72 小時(shí)后看結(jié)果。 結(jié)果判定：計(jì)算每瓶的空斑數(shù)。按公式： PFU/dose= 平均每瓶空斑數(shù) X 稀釋倍數(shù) X 復(fù)蘇疫苗所用液體體 積（ ml） 接種疫苗體積（ ml） X 疫苗頭份數(shù)（ dose） 計(jì)算 IBD 疫苗的 PFU/dose。作出疫苗檢測(cè)報(bào)告。 后勤供應(yīng) 常用培養(yǎng)基的制備 一、液體培養(yǎng)基 四硫磺酸鈉煌綠增菌液（ TTB） （ 1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基： 胨 5 克，膽鹽 1 克，碳酸鈣 10 克，硫代硫酸鈉（含水） 30 克，蒸餾水 1000 毫升。 （ 2）碘溶液：碘片 6 克，碘化鉀 5 克，蒸餾水 20 毫升。 （ 3）制法： 將基礎(chǔ)培養(yǎng)基的各種成分加入蒸餾水中，加熱溶解，根據(jù)需要分裝成瓶，分裝時(shí)應(yīng)隨時(shí)振搖，使其中的碳酸鈣混勻。 121℃高壓滅菌 15 分鐘備用。 臨用時(shí)每 100ml 基礎(chǔ)液加入碘溶液 2ml， ％煌溶液 1ml。 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 （ 1）成分：營(yíng)養(yǎng)肉湯（市面有售）。 （ 2）制法：稱取營(yíng)養(yǎng)肉湯 3 克 /100ml，根據(jù)需要可分裝成多種規(guī)格，加熱溶解，包裝滅菌， 15 磅壓力， 30 分鐘。 緩沖蛋白胨水（ BP） （ 1）成分：蛋白胨 10 克，氯化鈉 5 克，磷酸氫二鈉 9 克（無水 克），磷酸二氫鉀 克；蒸餾水 1000ml。 （ 2）制法：將上述成分混勻，加熱溶解，校正 PH 為 ，分裝滅菌， 15 磅壓力下滅菌 20 分鐘，臨用時(shí)以無菌操作分裝 試管或瓶中。 ％氯化鈉溶液 （ 1）成分：氯化鈉 90 克，蒸餾水 1 萬毫升。 （ 2）制法：稱取氯化鈉 90 克，倒入裝有 1 萬毫升蒸餾水的溶液，攪拌溶解。用氫氧化鈉調(diào) ，分裝入瓶在 15 磅壓力下滅菌 20 分鐘。 蒸餾水溶液 將蒸餾水用氫氯化鈉調(diào) ，分裝入瓶，在 15 磅壓力下滅菌 20 分鐘。 磷酸鹽緩沖液（ PBS） （ 1）成分：氯化鈉 8 克，氯化鉀 克，磷酸二氫鉀 克，磷酸氫二鈉 克。 （ 2）制法：將上述物質(zhì)混于水中，加熱溶解，混勻后分裝入瓶， 10 磅壓力，滅菌 20分鐘備用。 保存 液 （ 1）成分：葡萄糖 克，檸檬酸鈉 克，檸檬酸 克，氯化鈉 克，蒸餾水1000 毫升。 （ 2）制法：將上述各種物質(zhì)混于水中，加熱溶解，混勻后分裝入瓶， 10 磅壓力滅菌10 分鐘，放冰箱備用。 飽和鹽水 （ 1）成分：氯化鈉、蒸餾水。 （ 2）制法：在燒杯內(nèi)裝入氯化鈉（ 1000ml 水中加入約 400 克氯化鈉）用水煮沸。直到食鹽不再溶解為止，在室溫下冷卻，裝瓶備用，如溶液中出現(xiàn)結(jié)晶沉淀，為飽和溶液。 清潔液（弱）泡反應(yīng)板用 （ 1）成分：重酪酸鉀 1500 克，硫酸 2500 毫升，水 20 公斤。 （ 2） 制法：先用 1 公斤水熱水，將重酪酸鉀溶解后，然后放入溫水 19 公斤即可。 清潔液（強(qiáng)）泡玻璃器皿用 （ 1）成分：重酪酸鉀 1500 克，硫酸 15 瓶（ 2500ml/瓶），開水 3700 毫升。 （ 2）制法：先用開水 3700 毫升，將重酪酸鉀充分溶解，再緩緩的將硫酸倒入，邊倒邊攪勻，然后放入較為堅(jiān)固耐溶器內(nèi)。加入 1m的氫氯化鈉搖動(dòng)至 PH 值為 ，溶至 1000ml 即可。 二、固體培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 （ 1）成分：營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（市面有售）。 （ 2）制法：稱得 克營(yíng)養(yǎng)瓊脂，放入 500ml 的三角瓶中，混勻加熱 溶解， 15 磅壓力下滅菌 30 分鐘。取出后放水浴鍋中待冷至 50－ 55℃，傾注平板，涼后倒置備 用。 血液瓊脂培養(yǎng)基 （ 1）成分：榮立感應(yīng)培養(yǎng)基 100ml，脫纖維綿羊血液 10 毫升。 （ 2）制法：取滅菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 100 毫升，加熱溶化，待冷至 50℃時(shí)，以無菌手續(xù)加入脫纖血 10 毫升，輕輕搖勻，傾注于滅菌平皿中，經(jīng)無菌檢查后，即可放入冰箱中保存?zhèn)溆谩? 注意：瓊脂溫度以 50℃左右為宜，若溫度過高，血液變成暗褐色；溫度過低，瓊脂易凝固成塊。此外加入血液后，要輕輕搖勻，防止產(chǎn)生氣泡。 麥康凱瓊脂 （ 1）成分：麥康凱瓊 脂（市面有售）。 （ 2）制法：按 克 /100ml 比例，加入到蒸餾水中，混勻，加熱溶解。 10 磅壓力下滅菌 20 分鐘，待冷至 50－ 60℃時(shí)，傾注平板。 沙門氏菌志賀氏菌瓊脂（ SS 瓊脂） （ 1）成分： SS 瓊脂（市面有售） 克，蒸餾水 100 毫升。 （ 2）制法：將 SS 瓊脂放蒸餾水，混勻，加熱 100℃，使其全部溶解。冷卻到 60℃左右即可傾入平板凝固后，保存于冰箱備用。 注意：用前倒置溫箱中約 1 小時(shí)，使表面水分干燥，便于劃線分離。 本培養(yǎng)基均勻高壓滅菌或加熱時(shí)間過長(zhǎng)。 三糖鐵瓊脂 （ 1）成分：三糖鐵瓊脂（市 面有售） 克，蒸餾水 1000ml。 （ 2）制法：將上述成分混勻，加熱溶解，分裝試管 5－ 7 毫升， 8 磅壓力，滅菌 20 分鐘，趁熱制成使底層成柱狀，上層斜面，凝固后使用。 高鹽甘露醇瓊脂 （ 1）成分：蛋白胨 10 克，牛肉膏 1 克，氯化鈉 75 克，甘露醇 10 克，瓊脂 20 克，蒸餾水 1000 毫升， ％酚紅溶液 25 毫升。 （ 2）制法：將蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、瓊脂和蒸餾水混合后加熱溶解，校正 PH 至177。 ，趁熱加入甘露醇及酚紅溶液，充分混勻，分裝于三角瓶中， 10 磅滅菌15 分鐘，待冷至 55℃左右，傾注平板，凝固后 冷藏備用。 葡萄糖瓊脂 （ 1）成分：市售葡萄糖瓊脂 ，蒸餾水 100ml。 （ 2）制法：將 克葡萄糖瓊脂放入 100ml 蒸餾水中，加熱溶解， 10 磅壓力下滅菌 20分鐘，待冷至 55℃左右傾注平板。 磷酸鹽瓊擴(kuò)板 (PH=) （ 1）成分：磷酸氫二鈉 克（有水 克），磷酸二氫鉀 克，瓊脂 克，氯化鈉 40 克， 1％硫柳汞 5ml。蒸餾水 500 毫升。 （ 2）制法：先將瓊脂粉加入蒸餾水中，加熱溶解。趁熱放入磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉，校正 PH 為 ，加入 1％硫柳汞，攪拌均勻，冷至 55℃－ 60℃，傾注平板。每板厚為 3mm， 20ml。 磷酸鹽緩沖液板 （ PH=） （ 1）成分：磷酸氫二鈉 克，磷酸二氫鉀 48 克，氯化鈉 40 克，瓊脂粉 4 克（即 ％），蒸餾水 500 毫升， 1％硫柳汞 5ml。 PH 為 。 制法：先將瓊脂粉放入蒸餾水中加熱溶解。趁熱放入磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉、 1％硫柳汞 5ml，攪均后待冷至 60℃傾注平板，每板 20 毫升，厚為 3mm。 硼酸鹽瓊脂板（ BBS） （ 1）成分：四硼酸鈉 克，硼酸 克，瓊脂粉 5 克， 1％硫柳汞 5ml， PH 值 。 （ 2）制法：先將瓊脂粉放入蒸餾水中，加熱溶解