【正文】 時，陰陽性對照應(yīng)分別呈陰陽性結(jié)果。 二．免疫擴(kuò)散試驗 免疫擴(kuò)散試驗又稱瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗 (AGP)。將孔中的瓊脂用 68號針頭輕輕向上挑出即可。 2．陰性：受檢血清與抗原之間不形成沉淀線或者陽性血清的向毗鄰受檢孔直伸或其向外側(cè)偏彎者，此受檢血清判為陰性。 2．紅細(xì)胞凝集試驗（ HA） HA 試驗主要是測定病毒的紅細(xì)胞凝集價，以確定紅細(xì)胞凝集抑制試驗所用的病毒稀釋 倍數(shù)（抗原單位）。在 1822℃室溫下作用 40 分鐘后觀察結(jié)果。 41． 用 12 頭移液器向每個孔加入生理鹽水 毫升。 能將 4 單位病毒物質(zhì)凝集紅細(xì)胞的作用完全抑制的血清最高稀釋度倍數(shù)，稱為該血清的紅細(xì)胞凝集抑制效價，用以 2 為底數(shù)的對數(shù)（ Log2）表示。 25．用 12 頭移液器吸取 1%紅細(xì)胞懸浮液 加入各孔中。 2．在 A1， A2 孔中各加入 100ul 陰性對照樣品。 8．在每孔中加入 100ul兔抗 p27辣根過氧化物酶結(jié)合物。 16．計算結(jié)果。 3．用將近 300ul 一倍濃度的洗液洗滌每孔 4遍或更多次。 10．用空氣將酶聯(lián)儀調(diào)零。對于要取腦組織做病原分離的情況，則 只能用前一種方法。 11. 檢查腦、神經(jīng)。 組織水洗：將固定好的病變組織分成兩份，一份放回 10%福爾馬林溶液中作備份，另一份用紗布包裹后，用流水沖洗 56小時。浸蠟時間視組織塊大小可做適當(dāng)調(diào)整。 30分鐘，然后用鹽酸酒精分化液作用 1030秒鐘；繼續(xù)流水沖洗 1015分鐘； 25分鐘； ； 70%、 80%、 90%、 95%酒精溶液中脫水各 1分鐘；然后置于 100%酒精溶液中兩次 ，每次 23分鐘； 510 分鐘； ； 37℃溫箱中 2448 小時，烘干。檢查病雞群的血清學(xué)檢測結(jié)果。檢查其他有關(guān)化驗結(jié)果。 濾紙片：用打孔器將優(yōu)質(zhì)濾紙片制成直徑為 6毫米的圓形紙片，經(jīng) 121℃高壓蒸汽滅菌，干燥后密閉保存于 48℃冰箱中備用。 藥敏試驗檢驗程序 1 1 3 將培養(yǎng)皿放置于 37℃的恒溫箱中培養(yǎng) 1824 小時。 4 四個步驟一次。 取平皿培養(yǎng)基上的菌落轉(zhuǎn)接于適宜培養(yǎng)基表面，置 37℃ 1824 小時做純培養(yǎng)，以便做進(jìn)一步的檢查。必要時需做一系列的生化試驗和血清學(xué)試驗，對分離菌做詳細(xì)的鑒定。 稀釋 : 在無菌室內(nèi)將全部試管蓋兒打開 ,每管內(nèi)加入 4 毫升滅菌鹽水 ,浸泡 510 分鐘。觀察其菌落形態(tài)是否有可疑沙門氏菌落 ,若有無色半透明 。 生化試驗結(jié)果符合表 3 沙門氏菌特性的按 進(jìn)行。不同的曲霉分生孢子的顏色不一樣 ,有黃、蘭、青、黑綠、棕等色；鐮孢酶的菌絲有隔 ,產(chǎn)生在菌絲孢子上的分生孢子 ,大分生孢子呈鐮刀狀 ,有的呈豆角狀。 2 毫升吸管、 10 毫升吸管、平皿。 分組 :加 樣完畢 ,要將全部平皿分成四組放置，使每組的編號完全一樣，即每個棉拭子占用的四個平皿各為一組。 篩選試驗 : 在沙門氏志賀氏瓊脂平板至少應(yīng)選出 2 個典型或可疑沙門氏菌落分別接種于尿素試管培養(yǎng)基中并穿刺、劃線于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基試管中 .(為了防止遺漏 ,一般應(yīng)多挑幾個菌落進(jìn)行培養(yǎng) )于 37℃恒溫箱中培養(yǎng) 24 小時 (必要 時可延長止 48 小時 )觀察其 菌落形態(tài)及生化反應(yīng)。反之無自凝 性。 檢驗標(biāo)準(zhǔn) : 總菌數(shù) ≤ 32 大腸桿菌 : ≤ 8 沙門氏菌 : 0 萄葡球菌 : ≤ 8 霉菌 : ≤ 8 4．水樣的檢驗： . 細(xì)菌學(xué)方面 :主要檢查水中的大腸桿菌、葡萄球菌、沙門氏菌、綠膿桿菌、霉菌以及總的細(xì)菌含量。 B:在無菌室內(nèi)先將水樣瓶充分搖勻后 ,再打開瓶塞 ,從每個水樣瓶內(nèi)取出 4 毫升水樣分別加入 3 個平皿和一組試管的第一個試管內(nèi)，每個平皿內(nèi)加入 1 毫升，用于傾注 Mac、 MSA、 MM 培養(yǎng)基；試管內(nèi)的水樣用于傾注 NA，用 1 支 2 毫升吸管在第一個試管內(nèi)反復(fù)吸打使之均勻，取出 2 毫升， 1 毫升加入一個平皿中，另 1 毫升加入第二個試管內(nèi) ,繼續(xù)做倍比稀釋，做完的 3 個稀釋度分別為 10 102和 103。 : 我們通常選三個連續(xù)的稀釋度，如 10 10 103或 10 10 105,在三個稀釋度的培養(yǎng) 皿中 ,選菌落數(shù)在 30300 之間的那一稀釋度為準(zhǔn)；如稀釋度為 10 10103的三個平皿上 ,菌落數(shù)分別為 460、 5 7,總數(shù)計為 103(個 /ML)。 B:干熱消毒的 18mm 180mm玻璃試管、 2 毫升吸管、 10 毫升吸管、平皿、三角燒瓶 (100ml)、 50 毫升吸管、消毒好的紙袋 (裝墊料用 )等。 B:將墊料在三角燒瓶內(nèi)做 101稀釋、再用兩個試管做 102和 103稀釋 ,每個稀釋度取1 毫升加入一個平皿中，作總菌數(shù)測定；再從 101三角燒瓶中取 3 毫升 ,分別加入3 個平皿 ,每個平皿各加入 1 毫升 ,作大腸桿菌、葡萄球菌、霉菌計數(shù)用。 :取自現(xiàn)場。 37℃恒溫培養(yǎng)箱中。移液泵等。 37℃溫箱培養(yǎng) 2448 小時后 , 分別在營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、高鹽甘露醇瓊脂、霉菌培養(yǎng)基上計數(shù)總菌、大腸桿菌、葡萄球菌、霉菌數(shù)。 疫苗的稀釋：用含青霉素 G 鉀 100IU/ml，硫酸鏈霉素 100ug/ml 的 PBS 將使用濃度的疫苗作 10 倍系列稀釋 (101至 1010)。作出疫苗檢測報告。用 ReedMuench法計算疫苗的毒價 (EID50/Dose)。 接種：用稀釋度為 103至 107的疫苗液經(jīng)尿囊腔 接種雞胚 ,每個稀釋度接種 5 枚 ,每胚。作出疫苗檢測報告。 鋪營養(yǎng)瓊脂 ：傾去細(xì)胞瓶中的維持液。 疫苗接種：挑選生長良好的 CEF 原代細(xì)胞 ,傾去營養(yǎng)液 ,接種 病毒液。 后勤供應(yīng) 常用培養(yǎng)基的制備 一、液體培養(yǎng)基 四硫磺酸鈉煌綠增菌液（ TTB） （ 1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基： 胨 5 克，膽鹽 1 克，碳酸鈣 10 克，硫代硫酸鈉（含水） 30 克，蒸餾水 1000 毫升。 （ 2）制法：將上述成分混勻，加熱溶解，校正 PH 為 ，分裝滅菌， 15 磅壓力下滅菌 20 分鐘，臨用時以無菌操作分裝 試管或瓶中。 （ 2）制法：將上述各種物質(zhì)混于水中，加熱溶解，混勻后分裝入瓶， 10 磅壓力滅菌10 分鐘，放冰箱備用。加入 1m的氫氯化鈉搖動至 PH 值為 ，溶至 1000ml 即可。 麥康凱瓊脂 （ 1）成分：麥康凱瓊 脂（市面有售）。 三糖鐵瓊脂 （ 1）成分：三糖鐵瓊脂（市 面有售） 克，蒸餾水 1000ml。蒸餾水 500 毫升。 硼酸鹽瓊脂板（ BBS） （ 1）成分：四硼酸鈉 克，硼酸 克，瓊脂粉 5 克， 1％硫柳汞 5ml， PH 值 。 磷酸鹽緩沖液板 （ PH=） （ 1）成分：磷酸氫二鈉 克，磷酸二氫鉀 48 克，氯化鈉 40 克，瓊脂粉 4 克（即 ％），蒸餾水 500 毫升， 1％硫柳汞 5ml。 ，趁熱加入甘露醇及酚紅溶液，充分混勻，分裝于三角瓶中， 10 磅滅菌15 分鐘，待冷至 55℃左右，傾注平板，凝固后 冷藏備用。 （ 2）制法：將 SS 瓊脂放蒸餾水，混勻，加熱 100℃，使其全部溶解。 血液瓊脂培養(yǎng)基 （ 1）成分：榮立感應(yīng)培養(yǎng)基 100ml，脫纖維綿羊血液 10 毫升。 清潔液（弱）泡反應(yīng)板用 （ 1）成分：重酪酸鉀 1500 克，硫酸 2500 毫升，水 20 公斤。 蒸餾水溶液 將蒸餾水用氫氯化鈉調(diào) ，分裝入瓶，在 15 磅壓力下滅菌 20 分鐘。 臨用時每 100ml 基礎(chǔ)液加入碘溶液 2ml， ％煌溶液 1ml。 鋪第二層營養(yǎng)瓊脂：向第一層瓊脂上再加入含 %中性紅 ,1%瓊脂 ,5%犢牛血清的199，繼續(xù)培養(yǎng) 72 小時后看結(jié)果。按公式： PFU/dose= 平均每瓶空斑數(shù) X 稀釋倍數(shù) X 復(fù)蘇疫苗所用液體體積（ ml） 接種疫苗體積（ ml） X 疫苗頭份數(shù)（ dose） 計算 MD 疫苗的 PFU/dose。 MD 疫苗接種：挑選生長良好的 CEF 原代細(xì)胞 ,傾去營養(yǎng)液 ,接種 病毒液。收獲尿囊液并做 HA 試驗 ,如 NDV 血凝價大于 1:8，則該試驗不成立。 單價苗 IBV的毒價測定則必須首先把 NDV完全中和后再測定。 接種：用稀釋度為 103至 107的疫苗液經(jīng)尿囊腔接種雞胚 ,每個稀釋度接種 5 枚 ,每胚。 判定結(jié)果：孵育 7 天后看結(jié)果。檢測操作均為無菌操作。 (4 塊 ),用記號筆標(biāo)明與取水瓶編號相同的號碼。 2. 使用中的消毒劑的效力測定 為了驗證消毒劑在實際應(yīng)用中的效力 ,以確保消毒劑在現(xiàn)場真正起到殺菌消毒作用 ,應(yīng)隨時采集使用中的按要求配制的消毒液 ,測定其是否仍有消毒作用。 : ： 5 個測試濃度 ,將各濃度的消毒劑分裝于四個滅菌試管中 ,每管 5 毫升。 : 菌落計數(shù) :同水樣。 稱樣 :同絨毛 ,先稱滅菌三角燒瓶 ,然后無菌打開墊料袋 ,用消毒后的鑷子夾取墊料放入三角燒瓶中 ,每份墊料稱 1 克。 檢驗標(biāo)準(zhǔn) : 總菌數(shù) 105 大腸桿菌 0 葡萄球菌 0 沙門氏菌 0 綠膿桿菌 0 霉菌 102 二：雞舍的細(xì)菌監(jiān)測技術(shù) 1. 表面檢驗：雞舍內(nèi) 墻壁、地面及各種器物表面隨機(jī)選點采樣，檢驗程序與孵化場的種蛋、設(shè)備、工作間環(huán)境表面的程序相同。 : 菌落計數(shù) : A:培養(yǎng) 24 小時后取出營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、霉菌瓊脂培養(yǎng)基、高鹽甘露醇瓊脂培養(yǎng)基。 : 登記、編號 :化驗室接到樣品后，首先根據(jù)送檢單進(jìn)行清點，同時將所有樣品進(jìn)行統(tǒng)一化驗編號 ,并用記號筆標(biāo)記在相應(yīng)的送檢水瓶上。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基記數(shù)所有菌落為總菌數(shù)；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基記數(shù)粉紅色菌落數(shù)，通過生化 鑒定大腸桿菌；霉菌瓊脂培養(yǎng)基置于室溫下再經(jīng)過 24小時記數(shù)霉菌數(shù)。按表 3 進(jìn)行生化試 表 3. 沙門氏菌屬生化反應(yīng) 序號 生化項目 沙門氏菌反應(yīng) 1 尿素酶試驗 － 2 V－ P 試驗 － 3 賴氨酸脫羧酶試驗 ＋ 4 吲哚試驗 － 5 丙二酸鈉試驗 － 6 衛(wèi)矛醇試驗 反應(yīng)不定 所有生化試驗管均于 37℃培養(yǎng) 24 小時。 取增菌液一環(huán)劃線接種于沙門氏志賀氏瓊脂培養(yǎng)基 (SS)板上，然后將其置于 37℃恒溫箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。 操作人員必須雙手消毒、更換工作服、鞋、帽、戴口罩進(jìn)入無菌室。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基記數(shù)所有菌落為總菌數(shù)；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基記數(shù)紅色菌落數(shù)，通過 生化鑒定大腸桿菌 。 用沙門氏診斷血清做進(jìn)一步的血清學(xué)鑒定 . 對無自凝性的培養(yǎng)物 ,先以多價“ O”血清代替生理鹽水 ,在 2 分鐘內(nèi)判斷 結(jié)果。 表 1 三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基篩選 三糖鐵瓊脂 賴氨酸脫羧酶 初步判斷 斜面 底層 產(chǎn)氣 硫化氫 K A +() +() + 可疑沙門氏菌屬 K A +() +() _ 可疑沙門氏菌屬 表 2 三糖鐵瓊脂和尿素酶瓊脂篩選 三糖鐵瓊脂 尿素酶 瓊 脂 初步判斷 斜面 底層 產(chǎn)氣 硫化氫 K A +() +() _ 可疑沙門氏菌屬 A A +() +() _ 可疑亞 利桑那菌屬 注 ： K:產(chǎn)堿 。 傾注培養(yǎng)基 : 將水浴鍋中冷卻到 4852℃的 NA、