【正文】 瓊脂糖凝膠和血纖維蛋白等 。 微囊法：親水半透膜把細胞包埋在微囊內(nèi) 。 多聚賴氨酸 /海藻酸固定細胞：凝膠載體的表面被多聚賴氨酸覆蓋 ， 形成一層多孔可透薄膜 ， 再使凝膠載體液化 ，便可制成微囊 。 雜交瘤細胞與海藻酸鈉溶液混合 ， 經(jīng)微囊發(fā)生器 ， 微球滴入氯化鈣溶液中 ， 形成凝膠 ， 然后用聚氨基酸處理 ， 使微球表面成膜 ， 再用檸檬酸去鈣離子 ， 球內(nèi)海藻酸鈉成液態(tài) ，細胞在在微囊內(nèi)懸浮 。 微囊化固定培養(yǎng)工藝在單克隆抗體的生產(chǎn)中獲得成功 ， 使抗體截留在膜內(nèi) ， 血清中的蛋白質(zhì)被排出在膜外 ， 產(chǎn)物濃度和純度較高 。 培養(yǎng)結(jié)束后 ， 收獲微囊 ， 破微囊 ， 純化抗體 ， 純化工藝簡單 ， 應用前景廣 。 三 、 細胞培養(yǎng)的操作方式 動物細胞的培養(yǎng)的操作方式與微生物培養(yǎng)基本相同 。 （ 一 ） 分批式操作 已用于攪拌式反應器或氣升式反應器培養(yǎng)雜交瘤細胞 ， 生產(chǎn)單克隆抗體 。 分批培養(yǎng)雜交瘤和骨髓瘤細胞的周期為3～ 5天 ， 細胞密度達 2～ 5 105 /ml， 最大比生長速率大約為 h1。 單克隆抗體的產(chǎn)量約 10～ 100 mg/L。 在大規(guī)模攪拌反應器中 ， 細胞密度較低 ， 最終達 5 106， 而在750～ 1500 cm2的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)中 ， 細胞密度達 1～ 2 108。 (二 )流加式操作 最常見的流加物質(zhì)是葡萄糖 、 谷氨酰胺等能源和碳源物質(zhì) 。 通過流加控制 ， 可實現(xiàn)高密度培養(yǎng) 。 雜交瘤細胞培養(yǎng) ， 細胞密度可達 107， 生產(chǎn)抗體的產(chǎn)量比分批操作提高幾～ 10倍 ， 可達 500 mg/L。 由于培養(yǎng)體積不斷變化 ， 流加對過程的控制能力仍然有限 在實際生產(chǎn)中應用少 。 （ 三 ） 半連續(xù)式操作 動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥物中經(jīng)常采用 。 已應用于大規(guī)模生產(chǎn)乙肝表面抗原 、 tPA等基因工程產(chǎn)物 。 半連續(xù)操作特別適用于分泌表達型細胞 ， 如雜交瘤細胞的培養(yǎng) ， 尤其是微載體系統(tǒng) 。 微載體系統(tǒng)培養(yǎng)基因工程 CHO細胞 ， 待細胞長滿載體后 ，反復收獲細胞的分泌產(chǎn)物乙肝表面抗原 ， 制備乙肝疫苗 。 該方式操作簡單 ， 使細胞密度和產(chǎn)量維持在較高水平 ， 能在較長時間內(nèi)進行持續(xù)生產(chǎn) ， 反復收獲產(chǎn)物 ， 生產(chǎn)效率高 ，是動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥物中經(jīng)常被采用的方式 。 （ 四 ） 連續(xù)式操作 不斷收獲產(chǎn)物 ， 生產(chǎn)中用于非貼壁依賴性細胞培養(yǎng) 。 在動物細胞培養(yǎng)中 ， 比生長速率比稀釋速率大 。 很難建立單一限制性基質(zhì)的衡化培養(yǎng) ， 需要多種營養(yǎng)物質(zhì)流加 。 稀釋速率可從 0到最大生長速率之間變化 ， 高稀釋速率將帶出細胞 。 在穩(wěn)態(tài) ， 抗體的生產(chǎn)可維持幾個星期甚至幾個月 。 連續(xù)操作的培養(yǎng)條件穩(wěn)定 ， 抗體處于最佳生產(chǎn)狀態(tài) ， 可準確控制最優(yōu)化參數(shù) ， 產(chǎn)率較高 ， 但必須控制培養(yǎng)基的流加速度和液位高度 。 （ 五 ） 灌流式操作 細胞被截留在反應器內(nèi)的連續(xù)操作 ， 是最受推崇的用動物細胞生產(chǎn)藥物的方式 。 截留細胞方式：過濾系統(tǒng)有兩種 ， 一種是安裝在反應器內(nèi)部或外環(huán)的旋轉(zhuǎn)過濾器 ， 另一種是切線過濾設備 。 灌流體系： 100％ 截留細胞 ， 如固定化包埋細胞 ， 可通過中空纖維 、 平板膜 、 凝膠顆粒和微囊等實現(xiàn)；部分截留細胞 ， 如使用微載體系統(tǒng) 、 貼壁系統(tǒng) 、 分離懸浮系統(tǒng)等實現(xiàn) ，其中分離懸浮系統(tǒng)包括使用膜過濾 、 旋轉(zhuǎn)過濾 、 離心 、 重力沉降等分離技術(shù) 。 流化床包埋培養(yǎng)人鼠雜交瘤細胞 ， 整個反應器有效濃度達4 108/ml， 單位體積產(chǎn)量提高 200～ 300倍 。 優(yōu)點： 1） 大大提高了細胞生長密度和產(chǎn)物濃度 。 2） 利用培養(yǎng)基 ， 降低細胞代謝廢物 ， 細胞生長良好 。 3） 產(chǎn)物為分泌蛋白質(zhì) ， 滯留時間短 ， 避免了產(chǎn)物的聚合 、 降解等產(chǎn)量和活性形式的變化 ， 有利于純化 。 4） 中空纖維生物反應器 、 固定床或流化床反應器 、 膜生物反應器等的唯一可操作方式 。 缺點：要求復雜儀器設備控制灌流操作過程 ， 由于過濾器容易堵塞 ， 從而限制培養(yǎng)次數(shù) 。 四 、 動物細胞培養(yǎng)反應器 （ 一 ） 轉(zhuǎn)瓶 最早的大規(guī)模培養(yǎng)的反應器 。 結(jié)構(gòu)簡單 ， 操作培養(yǎng)簡便 ，不進行過程控制 。 現(xiàn)在主要用于生產(chǎn)疫苗如流行性腮腺炎 、風診麻疹等或用作種子罐 。 （ 二 ） 攪拌罐反應器 其結(jié)構(gòu)與微生物發(fā)酵罐相似 。 主要區(qū)別：較低的高徑比 ，滿足細胞對溶解氧的需求；低攪拌轉(zhuǎn)速 ， 大幅傾斜度槳葉或無槳 ， 避免機械傷害；圓形罐底 ， 防止細胞及載體沿體壁的沉積 。 大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)藥物的主要設備 ， 用于懸浮細胞 、 微載體 、微囊和巨載體培養(yǎng)等 。 (三 )氣升式生物反應器 沒有攪拌裝置 ， 氣體從罐底的噴射管進入反應器的導流管 。湍流溫和而且均勻 ， 循環(huán)量大 ， 細胞與培養(yǎng)液混合均勻 。剪切力小 ， 細胞的傷害小 。 噴射供氧 ， 氧傳遞速率高 ， 供氧良好 。 適用于懸浮細胞分批培養(yǎng) ， 微載體和連續(xù)培養(yǎng) 。已有全自動密閉結(jié)構(gòu)的氣升式反應器 ， 氣體從罐底輸入 ，沿中央內(nèi)管上升 ， 一部分氣體溢出 ， 另一部分被引導沿罐內(nèi)壁下降 ， 到達底部與新氣體混合再度上升 。 通過計算機控制混合氣體的組分 ， 維持培養(yǎng)基內(nèi)的容氧和 pH值 。 Celltech公司氣升式反應器培養(yǎng)雜交瘤細胞 ， 生產(chǎn)單克隆抗體 。 抗體合成大多數(shù)處于穩(wěn)定期和衰退期 ， 不同細胞株系 ， 生產(chǎn)周期為 140－ 400h。 從 10L逐級放大到 10000L， 共17d， 生產(chǎn)抗體 100g， 比傳統(tǒng)搖瓶提高約 5倍 。 (四 )流化床生物反應器 細胞固定在多孔微載體中 ， 培養(yǎng)基以適當?shù)牧魉僮韵露辖?jīng)過 ， 使多孔載體處于懸浮的流態(tài)的反應器 。 Verax公司 CF－ IMMO多級和 SF－ 2023流化床反應器 ， 用于生產(chǎn)疫苗和基因工程產(chǎn)品 。 上部微載體依靠沉降作用與培養(yǎng)基分離 ，一部分培養(yǎng)基被收集 ， 提取產(chǎn)物 ， 同時排出部分廢物；其余部分再流加等體積新培養(yǎng)基 ， 提供營養(yǎng) ， 實現(xiàn)高密度培養(yǎng) 。 這種反應器結(jié)構(gòu)比較簡單 ， 傳質(zhì)性能好 ，采用膜氣體交換器 ， 能快速提供氧氣 。 固定床反應器： 填料為無細胞毒性的生物兼容性可附著細胞的惰性材料 ， 可以是不銹鋼 、 玻璃陶瓷和塑料和合成高分子材料 。 與流化床反應器的區(qū)別為固定床反應器使用實心載體 ， 流化床反應器使用有孔載體 。 現(xiàn)用多級流化床和多孔微球培養(yǎng) 。 （ 五 ） 中空纖維生物反應器 一個特制的圓筒 ， 內(nèi)部裝有數(shù)千根中空纖維管束 。 接種孔 水套層 產(chǎn)物出口 培養(yǎng)基入口 產(chǎn)物出口 培養(yǎng)基入口 內(nèi)膜 外膜 腔室 細胞 培養(yǎng)基分散后 ,灌入床層 。 纖維管壁薄 ， 半透膜 ， 截留不同分子量 。 纖維管的空腔組成的內(nèi)室：灌流含氧氣的培養(yǎng)基 纖維管之間的空間組成的外室：細胞生長 。 細胞接種于外室 ， 貼附在纖維外壁 ， 吸收從內(nèi)室滲透出來的營養(yǎng)成分 ， 生長繁殖 。 1－ 3周后可占據(jù)所有的纖維空間 ， 并在纖維外壁表面上堆積成多層 ， 細胞密度可達 108/ml。 細胞分泌的產(chǎn)物和血清中的成分由于分子量較大而無法進入內(nèi)室 ， 產(chǎn)物只能在外室積累和濃縮 。 細胞代謝的廢物是小分子物質(zhì) ， 可滲透進入內(nèi)室 ， 從內(nèi)腔開口排出 ， 避免了對細胞的毒性 。 在收獲時 ， 打開纖維管之間的外室開口 ， 產(chǎn)物就流出來 。此時雖然細胞停止分裂 ， 但細胞的存活 、 健康和核形態(tài)不變 ， 代謝和分化功能仍可保持數(shù)月 。 纖維材料 :聚砜 、 丙烯共聚物 、 聚丙烯 、 纖維素 、 醋酸纖維素 、 聚甲基丙烯酸甲酯等 。 纖維素親水性強 ， 對滲透性影響較大 ， 不適合于 Vero細胞及其他貼壁細胞培養(yǎng) 。 醋酸纖維和聚甲基丙烯酸甲酯親水性弱 ， 極性大 ， 適宜于貼壁細胞培養(yǎng) 。 優(yōu)點 :占地小 ， 產(chǎn)量和質(zhì)量高 ， 成本低 。 不足 :不能重復使用 ， 不耐高壓滅菌 ， 只能用環(huán)氧乙烷等消毒劑滅菌 ， 不能取樣檢測 。 中空纖維反應器是模仿了生物體內(nèi)毛細血管系統(tǒng) ， 應用廣泛 ， 主要用于培養(yǎng)雜交瘤細胞生產(chǎn)單克隆抗體 。 已有多家公司生產(chǎn)制造和銷售中空纖維生物反應器 ， 其發(fā)展的趨勢是達到高密度培養(yǎng)的目的 。 第五節(jié) 動物細胞的增殖行為與培養(yǎng)過程動力學 一、動物細胞的增殖周期 單細胞增殖周期： 細胞間期 間期 1(G1)、 DNA合成期 (S期 )、 間期 2(G2) 細胞分裂期 （ M期 ） 。 M期為有絲分裂期 ， 超螺旋化的染色單體 ， 經(jīng)過前期 、 中期 、 后期和末期 ， 被紡錘體拉向兩極 ， 中間形成細胞板 ，一個細胞分裂成兩個子細胞 。 M期一般時間很短 ， 為 ～ 1小時 。 同一類細胞的周期及其各期持續(xù)時間是一定的 ， 但不同類型的細胞分裂周期及各期時間都不同 ， 差異主要取決于G1期 ， 而 S和 G2期相對穩(wěn)定 。 對連續(xù)細胞系 ， 失去了細胞周期控制 ， 培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基成分會影響細胞周期 。 當人工培養(yǎng)條件不適 ， 細胞將發(fā)生程序化死亡即凋亡過程 ， 整個細胞分解后被膜包裹形成凋亡小體 。 在培養(yǎng)過程中 ， 缺乏生長因子或血清 、 營養(yǎng)受限和逆境等均可引發(fā)凋亡發(fā)生 。 二 、 懸浮培養(yǎng)細胞生長動力學 體外培養(yǎng)的細胞是以群體形式進行增殖和生長的 ， 其動力學過程與單細胞微生物的生長相似 。 動物細胞培養(yǎng)的核心參數(shù)是活細胞濃度 ， 可用細胞比生長速率 （ μ） 、 比死亡速率 (Kd)和活細胞分數(shù) (fv)來描述 ， 計算生長動力學 。 1． 懸浮培養(yǎng)細胞生長一般動力學 充分混合的懸浮培養(yǎng)游離細胞的反應器 ， 假設流加操作時流出率為 0， 分批操作時流加率和流出率均為 0， 密度不變 ，反應器內(nèi)則質(zhì)量守恒： V： 反應器內(nèi)的培養(yǎng)液體積 ， Fi： 流加新培養(yǎng)液的體積速度 ， Fo：消耗培養(yǎng)液的體積流速 。 oiFFdtdV?? 假定總細胞處于平衡狀態(tài)： 總細胞的積累速率 =細胞的流加速率－細胞的流出速率＋細胞生長速率－細胞裂解速率。在不進料情況下，總細胞平衡： NVNFdtNVdapo ???? 0)(N：細胞總濃度， uap：表觀比生長速率，包括細胞的生長和死亡。 只有活細胞才能分裂 ， 并假定活細胞不發(fā)生死亡： dlvapNkNN ?? ??μ為真實比生長速率 。Nv為活細胞濃度 。 Nd為死 細胞濃度 。kl為死細胞比裂解速率。 活細胞占主導，死細胞裂解可忽略，即 k l ＝ 0，那么 vapvapfNN ??? ?? )( 當活細胞轉(zhuǎn)變?yōu)樗兰毎麜r，沒有直接改變細胞的總濃度，那么活細胞處于平衡： VNFNdtVNdvaovv ???? 0)(μa為活細胞表觀比生長率： dak?? ?? 對于連續(xù)培養(yǎng)，反應體積恒定，所以 Fi=Fo=F。 取樣對反應器 V的 影響可忽略。表觀比生長速率： DdtNdap ??)ln(?D為稀釋速率（ Fo/V） 細胞活性降低時， μ遠離 μap（ D恒定）。細胞死亡速率 ： dtNdDk vd)ln(??? ?在高稀釋速率下，死亡速率較低。 只有在低稀釋速率時，死亡速率才重要。 2． 分批培養(yǎng) 分批培養(yǎng)時 ， Fi=Fo=F=0。 用 D=0替換前面方程 ， 可得到分批培養(yǎng)的 μap、 μ、 kd。 dtNdap)ln(??dtNdk vd)ln(?? ?vapvapfNN ??? ?? )(在 kl較小時（穩(wěn)定期）成立，直到靜止后期或死亡期。 3． 流加培養(yǎng) 流加體積對反應器效率影響很大時 ， Fo=0， 但 Fi≠0， 所以 V不是常數(shù) 。 不用細胞濃度 ， 用細胞數(shù)目 （ 分別為 NV或 NvV） 解方程 ， 得出到流加培養(yǎng)時總細胞 、 活細胞的表觀比生長速率 、 比死亡速率分別為： dtNVdap)ln(??dtVN va)ln(? ? ?dtVNdk vdln?? ? 5． 截留細胞的連續(xù)培養(yǎng) 流出的總細胞濃度為 No=αsN， αs為流出液細胞濃度與反應器中細胞濃度的比率 ， 截留速率 （ 反應器中截留的細胞分數(shù) ） 為 1αs。 對于 Fi=Fo=F， V恒定的體系 ， 總細胞濃度為： NNDdtdNaps ?? ???D替換為 αsD，可得到 μap、 μ、 kd 6． 細胞裂解期 低稀釋速率的連續(xù)培養(yǎng) （ 無論細胞是否截留 ） 和分批培養(yǎng)的靜止后期和衰亡期 ， 細胞活性較低 ， 細胞裂解相當重要 。高速攪拌時 ， 細胞裂解也很嚴重 。 計量細胞生長參數(shù) ， 必須考慮細胞裂解 。 可用細胞釋放到培