【正文】 可用細(xì)胞釋放到培。高速攪拌時(shí) ， 細(xì)胞裂解也很嚴(yán)重 。 不用細(xì)胞濃度 ， 用細(xì)胞數(shù)目 （ 分別為 NV或 NvV） 解方程 ， 得出到流加培養(yǎng)時(shí)總細(xì)胞 、 活細(xì)胞的表觀比生長(zhǎng)速率 、 比死亡速率分別為： dtNVdap)ln(??dtVN va)ln(? ? ?dtVNdk vdln?? ? 5． 截留細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng) 流出的總細(xì)胞濃度為 No=αsN， αs為流出液細(xì)胞濃度與反應(yīng)器中細(xì)胞濃度的比率 ， 截留速率 （ 反應(yīng)器中截留的細(xì)胞分?jǐn)?shù) ） 為 1αs。 dtNdap)ln(??dtNdk vd)ln(?? ?vapvapfNN ??? ?? )(在 kl較小時(shí)（穩(wěn)定期）成立，直到靜止后期或死亡期。 2． 分批培養(yǎng) 分批培養(yǎng)時(shí) ， Fi=Fo=F=0。細(xì)胞死亡速率 ： dtNdDk vd)ln(??? ?在高稀釋速率下，死亡速率較低。 取樣對(duì)反應(yīng)器 V的 影響可忽略。kl為死細(xì)胞比裂解速率。Nv為活細(xì)胞濃度 。在不進(jìn)料情況下，總細(xì)胞平衡： NVNFdtNVdapo ???? 0)(N：細(xì)胞總濃度， uap：表觀比生長(zhǎng)速率，包括細(xì)胞的生長(zhǎng)和死亡。 1． 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)一般動(dòng)力學(xué) 充分混合的懸浮培養(yǎng)游離細(xì)胞的反應(yīng)器 ， 假設(shè)流加操作時(shí)流出率為 0， 分批操作時(shí)流加率和流出率均為 0， 密度不變 ，反應(yīng)器內(nèi)則質(zhì)量守恒： V： 反應(yīng)器內(nèi)的培養(yǎng)液體積 ， Fi： 流加新培養(yǎng)液的體積速度 ， Fo：消耗培養(yǎng)液的體積流速 。 二 、 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué) 體外培養(yǎng)的細(xì)胞是以群體形式進(jìn)行增殖和生長(zhǎng)的 ， 其動(dòng)力學(xué)過程與單細(xì)胞微生物的生長(zhǎng)相似 。 當(dāng)人工培養(yǎng)條件不適 ， 細(xì)胞將發(fā)生程序化死亡即凋亡過程 ， 整個(gè)細(xì)胞分解后被膜包裹形成凋亡小體 。 同一類細(xì)胞的周期及其各期持續(xù)時(shí)間是一定的 ， 但不同類型的細(xì)胞分裂周期及各期時(shí)間都不同 ， 差異主要取決于G1期 ， 而 S和 G2期相對(duì)穩(wěn)定 。 M期為有絲分裂期 ， 超螺旋化的染色單體 ， 經(jīng)過前期 、 中期 、 后期和末期 ， 被紡錘體拉向兩極 ， 中間形成細(xì)胞板 ，一個(gè)細(xì)胞分裂成兩個(gè)子細(xì)胞 。 已有多家公司生產(chǎn)制造和銷售中空纖維生物反應(yīng)器 ， 其發(fā)展的趨勢(shì)是達(dá)到高密度培養(yǎng)的目的 。 不足 :不能重復(fù)使用 ， 不耐高壓滅菌 ， 只能用環(huán)氧乙烷等消毒劑滅菌 ， 不能取樣檢測(cè) 。 醋酸纖維和聚甲基丙烯酸甲酯親水性弱 ， 極性大 ， 適宜于貼壁細(xì)胞培養(yǎng) 。 纖維材料 :聚砜 、 丙烯共聚物 、 聚丙烯 、 纖維素 、 醋酸纖維素 、 聚甲基丙烯酸甲酯等 。 在收獲時(shí) ， 打開纖維管之間的外室開口 ， 產(chǎn)物就流出來 。 細(xì)胞分泌的產(chǎn)物和血清中的成分由于分子量較大而無法進(jìn)入內(nèi)室 ， 產(chǎn)物只能在外室積累和濃縮 。 細(xì)胞接種于外室 ， 貼附在纖維外壁 ， 吸收從內(nèi)室滲透出來的營(yíng)養(yǎng)成分 ， 生長(zhǎng)繁殖 。 纖維管壁薄 ， 半透膜 ， 截留不同分子量 。 （ 五 ） 中空纖維生物反應(yīng)器 一個(gè)特制的圓筒 ， 內(nèi)部裝有數(shù)千根中空纖維管束 。 與流化床反應(yīng)器的區(qū)別為固定床反應(yīng)器使用實(shí)心載體 ， 流化床反應(yīng)器使用有孔載體 。 這種反應(yīng)器結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單 ， 傳質(zhì)性能好 ，采用膜氣體交換器 ， 能快速提供氧氣 。 Verax公司 CF－ IMMO多級(jí)和 SF－ 2023流化床反應(yīng)器 ， 用于生產(chǎn)疫苗和基因工程產(chǎn)品 。 從 10L逐級(jí)放大到 10000L， 共17d， 生產(chǎn)抗體 100g， 比傳統(tǒng)搖瓶提高約 5倍 。 Celltech公司氣升式反應(yīng)器培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞 ， 生產(chǎn)單克隆抗體 。已有全自動(dòng)密閉結(jié)構(gòu)的氣升式反應(yīng)器 ， 氣體從罐底輸入 ，沿中央內(nèi)管上升 ， 一部分氣體溢出 ， 另一部分被引導(dǎo)沿罐內(nèi)壁下降 ， 到達(dá)底部與新氣體混合再度上升 。 噴射供氧 ， 氧傳遞速率高 ， 供氧良好 。湍流溫和而且均勻 ， 循環(huán)量大 ， 細(xì)胞與培養(yǎng)液混合均勻 。 大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)藥物的主要設(shè)備 ， 用于懸浮細(xì)胞 、 微載體 、微囊和巨載體培養(yǎng)等 。 （ 二 ） 攪拌罐反應(yīng)器 其結(jié)構(gòu)與微生物發(fā)酵罐相似 。 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單 ， 操作培養(yǎng)簡(jiǎn)便 ，不進(jìn)行過程控制 。 缺點(diǎn)：要求復(fù)雜儀器設(shè)備控制灌流操作過程 ， 由于過濾器容易堵塞 ， 從而限制培養(yǎng)次數(shù) 。 3） 產(chǎn)物為分泌蛋白質(zhì) ， 滯留時(shí)間短 ， 避免了產(chǎn)物的聚合 、 降解等產(chǎn)量和活性形式的變化 ， 有利于純化 。 優(yōu)點(diǎn)： 1） 大大提高了細(xì)胞生長(zhǎng)密度和產(chǎn)物濃度 。 灌流體系： 100％ 截留細(xì)胞 ， 如固定化包埋細(xì)胞 ， 可通過中空纖維 、 平板膜 、 凝膠顆粒和微囊等實(shí)現(xiàn)；部分截留細(xì)胞 ， 如使用微載體系統(tǒng) 、 貼壁系統(tǒng) 、 分離懸浮系統(tǒng)等實(shí)現(xiàn) ，其中分離懸浮系統(tǒng)包括使用膜過濾 、 旋轉(zhuǎn)過濾 、 離心 、 重力沉降等分離技術(shù) 。 （ 五 ） 灌流式操作 細(xì)胞被截留在反應(yīng)器內(nèi)的連續(xù)操作 ， 是最受推崇的用動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)藥物的方式 。 在穩(wěn)態(tài) ， 抗體的生產(chǎn)可維持幾個(gè)星期甚至幾個(gè)月 。 很難建立單一限制性基質(zhì)的衡化培養(yǎng) ， 需要多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流加 。 （ 四 ） 連續(xù)式操作 不斷收獲產(chǎn)物 ， 生產(chǎn)中用于非貼壁依賴性細(xì)胞培養(yǎng) 。 微載體系統(tǒng)培養(yǎng)基因工程 CHO細(xì)胞 ， 待細(xì)胞長(zhǎng)滿載體后 ，反復(fù)收獲細(xì)胞的分泌產(chǎn)物乙肝表面抗原 ， 制備乙肝疫苗 。 已應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)乙肝表面抗原 、 tPA等基因工程產(chǎn)物 。 由于培養(yǎng)體積不斷變化 ， 流加對(duì)過程的控制能力仍然有限 在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用少 。 通過流加控制 ， 可實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng) 。 在大規(guī)模攪拌反應(yīng)器中 ， 細(xì)胞密度較低 ， 最終達(dá) 5 106， 而在750～ 1500 cm2的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)中 ， 細(xì)胞密度達(dá) 1～ 2 108。 分批培養(yǎng)雜交瘤和骨髓瘤細(xì)胞的周期為3～ 5天 ， 細(xì)胞密度達(dá) 2～ 5 105 /ml， 最大比生長(zhǎng)速率大約為 h1。 三 、 細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式 動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)的操作方式與微生物培養(yǎng)基本相同 。 微囊化固定培養(yǎng)工藝在單克隆抗體的生產(chǎn)中獲得成功 ， 使抗體截留在膜內(nèi) ， 血清中的蛋白質(zhì)被排出在膜外 ， 產(chǎn)物濃度和純度較高 。 多聚賴氨酸 /海藻酸固定細(xì)胞：凝膠載體的表面被多聚賴氨酸覆蓋 ， 形成一層多孔可透薄膜 ， 再使凝膠載體液化 ，便可制成微囊 。 包埋材料有人工聚合物 、瓊脂糖凝膠和血纖維蛋白等 。 包埋：細(xì)胞包埋在載體內(nèi)部 。 吸附：通過物理吸附使細(xì)胞貼附在固體載體表面 ， 微載體和中空纖維培養(yǎng)等 。 適宜于貼壁依賴性和非貼壁依賴性細(xì)胞的培養(yǎng) 。 細(xì)胞體積小 ， 密度低 ， 培養(yǎng)病毒易失去標(biāo)記而降低免疫能力 。 常用的反應(yīng)器有通氣式攪拌混和氣升式生物反應(yīng)器 。 動(dòng)物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是在微生物發(fā)酵的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的 ，經(jīng)常借鑒發(fā)酵理論和經(jīng)驗(yàn) ， 但有自身的特點(diǎn) ， 由于動(dòng)物細(xì)胞沒有細(xì)胞壁 ， 不能耐受劇烈的攪拌和通氣剪切 ， 對(duì)環(huán)境適應(yīng)性差 。 理想的微載體所具備的性能： 質(zhì)地柔軟 ， 微球間摩擦輕；耐高溫 ， 可高壓滅菌；透明性 ，便于觀察細(xì)胞生長(zhǎng)；細(xì)胞相容性 ， 利于貼附和生長(zhǎng)；無毒性和惰性 ， 對(duì)細(xì)胞無毒害 ， 不產(chǎn)生有害物質(zhì) ， 不吸附培養(yǎng)基；低速即懸浮 ， 靜止即沉降 ， 便于換液和收獲；微粒大小均勻；可回收重復(fù)使用 。 商品化的微球基質(zhì)是葡聚糖 、 聚丙烯酰胺 、 明膠交聯(lián) 、 聚苯乙烯和纖維素等 ， 帶電基團(tuán)為 DEAE等 。 貼壁培養(yǎng)的固體表面要求： 正電荷和高度表面活性 。 廣泛使用的多孔微載體有 Cellsnow、 Cytocell（纖維素基質(zhì)）、 Verax、 Cultisphere（膠原）、 Cytoline 1和 2（聚苯乙烯）、 ImmobaSil（硅橡膠）及 Siran（玻璃）等。 在懸浮培養(yǎng)早期，還可向培養(yǎng)液補(bǔ)充丙酮酸、腺嘌呤、次黃嘌呤、胸腺嘧啶等。 微載體的選擇依賴于攪拌系統(tǒng)和工藝過程，可用于轉(zhuǎn)瓶、攪拌燒瓶和氣升式反應(yīng)器等。 塑料載體 Biosilon是聚乙烯載體 ， 無吸附性能 ， 可重復(fù)使用 ， 但貼壁較慢 ， 對(duì)細(xì)胞的摩擦損傷較大 。 Cytodex 2： 電荷性大大下降 ， 吸附能力很低 ， 適合于蛋白質(zhì)藥物的生產(chǎn) 。 在玻璃表面覆蓋塑料 ， 可得到低密度微載體 ， 如Bioglas和 Ventreglas， 而中空玻璃也可達(dá)到此密度 。 商品化的微載體基質(zhì)有玻璃 、 葡聚糖 、纖維素 、 塑料和明膠等 ， 表面帶電基團(tuán)為 DEAE等 。 懸浮微球使細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境均一 ， 培養(yǎng)基利用率高 ， 重復(fù)性好 ， 減少了勞動(dòng)強(qiáng)度 ， 容易放大 ， 于 20世紀(jì) 80年代正式用于工業(yè)化生產(chǎn)干擾素 、 疫苗和尿激酶原等 。 2． 微載體培養(yǎng) 微載體為三維培養(yǎng)系統(tǒng) ， 細(xì)胞貼附于微載體上伸展和增殖 ，再懸浮于培養(yǎng)液中 。 優(yōu)點(diǎn)：容易更換培養(yǎng)液 ， 灌注培養(yǎng)時(shí) ， 能達(dá)到高細(xì)胞密度；有利于產(chǎn)物的分泌表達(dá) ， 可改變培養(yǎng)液與細(xì)胞的比例 。 細(xì)胞貼壁原理： 細(xì)胞主要靠靜電引力和范德華力貼附在固體表面 ， 因?yàn)閯?dòng)物細(xì)胞在生理狀態(tài)下帶負(fù)電 ， 貼壁培養(yǎng)的固體表面要求具有正電荷和高表面活性 。 貼壁培養(yǎng)容器 :轉(zhuǎn)瓶 、 玻璃珠 、 微載體和中空纖維等 。 接種后 ， 細(xì)胞經(jīng)過吸附 、 接觸而 貼附于基質(zhì)表面 ， 然后進(jìn)行 生長(zhǎng) 、 分裂繁殖 ， 很快進(jìn)入對(duì)數(shù)期 。 1. 單層貼壁培養(yǎng) 細(xì)胞貼附于一定的固體支持表面上 ， 進(jìn)行的培養(yǎng)方法 。 融化后的細(xì)胞可用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn) 。 復(fù)蘇細(xì)胞： 冷凍細(xì)胞取出 ， 立即在 37℃ 水浴中 ， 快速融化 。分裝 ， 火焰下封口 。 WCB1 QC WCB2 QC QC 原始培養(yǎng)物 MCB QC內(nèi)容：細(xì)胞活性檢測(cè)、無菌實(shí)驗(yàn)、核型、DNA分析、同工酶分析、支原體試驗(yàn)、其他外源物試驗(yàn)、穩(wěn)定性和基因型分析等，工作細(xì)胞庫(kù)必須與主細(xì)胞庫(kù)完全一致。 曾經(jīng)廣泛應(yīng)用 ， 但不是理想的生產(chǎn)細(xì)胞系 3. 細(xì)胞系的建立與保存 一旦獲得了穩(wěn)定的有一定特性的細(xì)胞系 ， 就建立細(xì)胞庫(kù) ，進(jìn)行長(zhǎng)期保存 。 過程與原代細(xì)胞相同 ， 用 30－ 50倍體的 ％ 胰蛋白酶和 EDTA對(duì)細(xì)胞塊消化 ， 消化后再培養(yǎng) 。 胰蛋白酶：細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織 ，胚胎 、 肝 、 腎及傳代細(xì)胞 膠原酶：纖維 、 上皮 、 癌組織 工作濃度： mg/ml 鏈霉蛋白酶 、 粘蛋白酶 、 蝸牛酶 2. 傳代細(xì)胞培養(yǎng) 長(zhǎng)滿器皿表面的細(xì)胞進(jìn)行分離 ， 接種到新的培養(yǎng)基上 ，進(jìn)行新一輪培養(yǎng) 。 1. 原代細(xì)胞系的分離與培養(yǎng) 用原代細(xì)胞系生產(chǎn)藥物需要大量的動(dòng)物 。 細(xì)胞無限傳代 ， 使大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)藥物成為可能 。 中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞 、 小鼠 L929細(xì)胞 、 BHK細(xì)胞 。 血液 、 淋巴細(xì)胞 、 腫瘤細(xì)胞和某些轉(zhuǎn)化細(xì)胞屬于此類 ， 生長(zhǎng)干擾素的Namalwa細(xì)胞 。 貼壁依賴性細(xì)胞：生長(zhǎng)需要在適量帶電荷的固體或半固體支持表面 ， 細(xì)胞自身分泌或人為在培養(yǎng)基中加入貼附因子 ，使細(xì)胞依附在支持物表面 ， 才能生長(zhǎng)和增殖 ， 大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞都屬于此類 。 細(xì)胞壽命無限 ， 生長(zhǎng)不受細(xì)胞密度的影響 ， 倍增時(shí)間短不具接觸抑制現(xiàn)象 ， 它對(duì)培養(yǎng)條件和生長(zhǎng)因子等要求低 ，非常適合于工業(yè)化生產(chǎn) ， 理想的藥物生產(chǎn)細(xì)胞系 。 如腫瘤細(xì)胞就是自發(fā)形成的永久細(xì)胞系 ， 沒有分裂次數(shù)的限制 。 有限細(xì)胞系 :正常細(xì)胞經(jīng)過多次傳代后 ， 一般可連續(xù)培養(yǎng)30－ 50代 ， 就會(huì)逐漸失去增殖能力 ， 也就是說它們只能生長(zhǎng)有限的時(shí)間 ， 經(jīng)過若干傳代培養(yǎng)后將老化死亡 。 如 WI－ 3 MRC－ 2BS等用于生產(chǎn) 。 傳代后 ， 細(xì)胞分裂增殖旺盛 ，能保持一致的二倍體核型 ， 所以又成為二倍體細(xì)胞系 。 生產(chǎn)中有些產(chǎn)品仍沿用原代細(xì)胞 ，如雞胚細(xì)胞 ， 兔或鼠腎細(xì)胞 、 淋巴細(xì)胞 。 體外培養(yǎng)細(xì)胞 ， 可分為原代細(xì)胞系 、 傳代細(xì)胞 。 在胚胎發(fā)育過程中 ， 高等動(dòng)物細(xì)胞的分化是由全能性變成多能性 ， 再變成單能性 ， 進(jìn)而失去再分化的能力 。 不同細(xì)胞具有不同的功能 ， 細(xì)胞分化異常導(dǎo)致癌變 。 三 、 群體細(xì)胞生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù) 細(xì)胞分裂代數(shù) G就可用下列公式計(jì)算： G＝ logN－ logN0） /log2 第四節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 一、細(xì)胞的種類 生物體是由多種多樣的分化細(xì)胞構(gòu)成 ， 如人體的細(xì)胞類型達(dá) 200余種 。 3. 靜止期 ：分裂數(shù)與死亡數(shù)相等的相對(duì)動(dòng)態(tài)平衡時(shí)期 。 2. 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：細(xì)胞分裂旺盛 ， 指數(shù)增加 。在培養(yǎng)過程中，缺乏生長(zhǎng)因子或血清、營(yíng)養(yǎng)受限和逆境等可引發(fā)凋亡發(fā)生。 不同的細(xì)胞類型其分裂周期及各期的時(shí)間都不同，培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基成分也會(huì)影響細(xì)胞周期 ,一般地動(dòng)物細(xì)胞分裂周期為 12－ 48小時(shí) ,典型的細(xì)胞周期為 24小時(shí)。 第二節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)過程 一、單細(xì)胞生長(zhǎng)增殖周期 從一個(gè)細(xì)胞分裂形成兩個(gè)新細(xì)胞的過程為一個(gè)細(xì)胞周期或一個(gè)細(xì)胞世代 。 一般情況下 ， 培養(yǎng)基成分如氨基酸 、 維生素 、 葡