【正文】 可用細胞釋放到培養(yǎng)液中的乳酸。高速攪拌時 ， 細胞裂解也很嚴重 。 不用細胞濃度 ， 用細胞數目 （ 分別為 NV或 NvV） 解方程 ， 得出到流加培養(yǎng)時總細胞 、 活細胞的表觀比生長速率 、 比死亡速率分別為： dtNVdap)ln(??dtVN va)ln(? ? ?dtVNdk vdln?? ? 5． 截留細胞的連續(xù)培養(yǎng) 流出的總細胞濃度為 No=αsN， αs為流出液細胞濃度與反應器中細胞濃度的比率 ， 截留速率 （ 反應器中截留的細胞分數 ） 為 1αs。 dtNdap)ln(??dtNdk vd)ln(?? ?vapvapfNN ??? ?? )(在 kl較小時（穩(wěn)定期）成立，直到靜止后期或死亡期。 2． 分批培養(yǎng) 分批培養(yǎng)時 ， Fi=Fo=F=0。細胞死亡速率 ： dtNdDk vd)ln(??? ?在高稀釋速率下，死亡速率較低。 取樣對反應器 V的 影響可忽略。kl為死細胞比裂解速率。Nv為活細胞濃度 。在不進料情況下，總細胞平衡： NVNFdtNVdapo ???? 0)(N：細胞總濃度， uap：表觀比生長速率，包括細胞的生長和死亡。 1． 懸浮培養(yǎng)細胞生長一般動力學 充分混合的懸浮培養(yǎng)游離細胞的反應器 ， 假設流加操作時流出率為 0， 分批操作時流加率和流出率均為 0， 密度不變 ，反應器內則質量守恒： V： 反應器內的培養(yǎng)液體積 ， Fi： 流加新培養(yǎng)液的體積速度 ， Fo：消耗培養(yǎng)液的體積流速 。 二 、 懸浮培養(yǎng)細胞生長動力學 體外培養(yǎng)的細胞是以群體形式進行增殖和生長的 ， 其動力學過程與單細胞微生物的生長相似 。 當人工培養(yǎng)條件不適 ， 細胞將發(fā)生程序化死亡即凋亡過程 ， 整個細胞分解后被膜包裹形成凋亡小體 。 同一類細胞的周期及其各期持續(xù)時間是一定的 ， 但不同類型的細胞分裂周期及各期時間都不同 ， 差異主要取決于G1期 ， 而 S和 G2期相對穩(wěn)定 。 M期為有絲分裂期 ， 超螺旋化的染色單體 ， 經過前期 、 中期 、 后期和末期 ， 被紡錘體拉向兩極 ， 中間形成細胞板 ，一個細胞分裂成兩個子細胞 。 已有多家公司生產制造和銷售中空纖維生物反應器 ， 其發(fā)展的趨勢是達到高密度培養(yǎng)的目的 。 不足 :不能重復使用 ， 不耐高壓滅菌 ， 只能用環(huán)氧乙烷等消毒劑滅菌 ， 不能取樣檢測 。 醋酸纖維和聚甲基丙烯酸甲酯親水性弱 ， 極性大 ， 適宜于貼壁細胞培養(yǎng) 。 纖維材料 :聚砜 、 丙烯共聚物 、 聚丙烯 、 纖維素 、 醋酸纖維素 、 聚甲基丙烯酸甲酯等 。 在收獲時 ， 打開纖維管之間的外室開口 ， 產物就流出來 。 細胞分泌的產物和血清中的成分由于分子量較大而無法進入內室 ， 產物只能在外室積累和濃縮 。 細胞接種于外室 ， 貼附在纖維外壁 ， 吸收從內室滲透出來的營養(yǎng)成分 ， 生長繁殖 。 纖維管壁薄 ， 半透膜 ， 截留不同分子量 。 （ 五 ） 中空纖維生物反應器 一個特制的圓筒 ， 內部裝有數千根中空纖維管束 。 與流化床反應器的區(qū)別為固定床反應器使用實心載體 ， 流化床反應器使用有孔載體 。 這種反應器結構比較簡單 ， 傳質性能好 ，采用膜氣體交換器 ， 能快速提供氧氣 。 Verax公司 CF－ IMMO多級和 SF－ 2023流化床反應器 ， 用于生產疫苗和基因工程產品 。 從 10L逐級放大到 10000L， 共17d， 生產抗體 100g， 比傳統搖瓶提高約 5倍 。 Celltech公司氣升式反應器培養(yǎng)雜交瘤細胞 ， 生產單克隆抗體 。已有全自動密閉結構的氣升式反應器 ， 氣體從罐底輸入 ，沿中央內管上升 ， 一部分氣體溢出 ， 另一部分被引導沿罐內壁下降 ， 到達底部與新氣體混合再度上升 。 噴射供氧 ， 氧傳遞速率高 ， 供氧良好 。湍流溫和而且均勻 ， 循環(huán)量大 ， 細胞與培養(yǎng)液混合均勻 。 大規(guī)模培養(yǎng)生產藥物的主要設備 ， 用于懸浮細胞 、 微載體 、微囊和巨載體培養(yǎng)等 。 （ 二 ） 攪拌罐反應器 其結構與微生物發(fā)酵罐相似 。 結構簡單 ， 操作培養(yǎng)簡便 ，不進行過程控制 。 缺點：要求復雜儀器設備控制灌流操作過程 ， 由于過濾器容易堵塞 ， 從而限制培養(yǎng)次數 。 3） 產物為分泌蛋白質 ， 滯留時間短 ， 避免了產物的聚合 、 降解等產量和活性形式的變化 ， 有利于純化 。 優(yōu)點： 1） 大大提高了細胞生長密度和產物濃度 。 灌流體系： 100％ 截留細胞 ， 如固定化包埋細胞 ， 可通過中空纖維 、 平板膜 、 凝膠顆粒和微囊等實現；部分截留細胞 ， 如使用微載體系統 、 貼壁系統 、 分離懸浮系統等實現 ，其中分離懸浮系統包括使用膜過濾 、 旋轉過濾 、 離心 、 重力沉降等分離技術 。 （ 五 ） 灌流式操作 細胞被截留在反應器內的連續(xù)操作 ， 是最受推崇的用動物細胞生產藥物的方式 。 在穩(wěn)態(tài) ， 抗體的生產可維持幾個星期甚至幾個月 。 很難建立單一限制性基質的衡化培養(yǎng) ， 需要多種營養(yǎng)物質流加 。 （ 四 ） 連續(xù)式操作 不斷收獲產物 ， 生產中用于非貼壁依賴性細胞培養(yǎng) 。 微載體系統培養(yǎng)基因工程 CHO細胞 ， 待細胞長滿載體后 ，反復收獲細胞的分泌產物乙肝表面抗原 ， 制備乙肝疫苗 。 已應用于大規(guī)模生產乙肝表面抗原 、 tPA等基因工程產物 。 由于培養(yǎng)體積不斷變化 ， 流加對過程的控制能力仍然有限 在實際生產中應用少 。 通過流加控制 ， 可實現高密度培養(yǎng) 。 在大規(guī)模攪拌反應器中 ， 細胞密度較低 ， 最終達 5 106， 而在750～ 1500 cm2的轉瓶生產中 ， 細胞密度達 1～ 2 108。 分批培養(yǎng)雜交瘤和骨髓瘤細胞的周期為3～ 5天 ， 細胞密度達 2～ 5 105 /ml， 最大比生長速率大約為 h1。 三 、 細胞培養(yǎng)的操作方式 動物細胞的培養(yǎng)的操作方式與微生物培養(yǎng)基本相同 。 微囊化固定培養(yǎng)工藝在單克隆抗體的生產中獲得成功 ， 使抗體截留在膜內 ， 血清中的蛋白質被排出在膜外 ， 產物濃度和純度較高 。 多聚賴氨酸 /海藻酸固定細胞：凝膠載體的表面被多聚賴氨酸覆蓋 ， 形成一層多孔可透薄膜 ， 再使凝膠載體液化 ，便可制成微囊 。 包埋材料有人工聚合物 、瓊脂糖凝膠和血纖維蛋白等 。 包埋：細胞包埋在載體內部 。 吸附：通過物理吸附使細胞貼附在固體載體表面 ， 微載體和中空纖維培養(yǎng)等 。 適宜于貼壁依賴性和非貼壁依賴性細胞的培養(yǎng) 。 細胞體積小 ， 密度低 ， 培養(yǎng)病毒易失去標記而降低免疫能力 。 常用的反應器有通氣式攪拌混和氣升式生物反應器 。 動物細胞懸浮培養(yǎng)是在微生物發(fā)酵的基礎上發(fā)展而來的 ，經常借鑒發(fā)酵理論和經驗 ， 但有自身的特點 ， 由于動物細胞沒有細胞壁 ， 不能耐受劇烈的攪拌和通氣剪切 ， 對環(huán)境適應性差 。 理想的微載體所具備的性能： 質地柔軟 ， 微球間摩擦輕；耐高溫 ， 可高壓滅菌；透明性 ，便于觀察細胞生長；細胞相容性 ， 利于貼附和生長；無毒性和惰性 ， 對細胞無毒害 ， 不產生有害物質 ， 不吸附培養(yǎng)基；低速即懸浮 ， 靜止即沉降 ， 便于換液和收獲；微粒大小均勻；可回收重復使用 。 商品化的微球基質是葡聚糖 、 聚丙烯酰胺 、 明膠交聯 、 聚苯乙烯和纖維素等 ， 帶電基團為 DEAE等 。 貼壁培養(yǎng)的固體表面要求： 正電荷和高度表面活性 。 廣泛使用的多孔微載體有 Cellsnow、 Cytocell（纖維素基質）、 Verax、 Cultisphere（膠原）、 Cytoline 1和 2（聚苯乙烯）、 ImmobaSil（硅橡膠）及 Siran（玻璃）等。 在懸浮培養(yǎng)早期，還可向培養(yǎng)液補充丙酮酸、腺嘌呤、次黃嘌呤、胸腺嘧啶等。 微載體的選擇依賴于攪拌系統和工藝過程，可用于轉瓶、攪拌燒瓶和氣升式反應器等。 塑料載體 Biosilon是聚乙烯載體 ， 無吸附性能 ， 可重復使用 ， 但貼壁較慢 ， 對細胞的摩擦損傷較大 。 Cytodex 2： 電荷性大大下降 ， 吸附能力很低 ， 適合于蛋白質藥物的生產 。 在玻璃表面覆蓋塑料 ， 可得到低密度微載體 ， 如Bioglas和 Ventreglas， 而中空玻璃也可達到此密度 。 商品化的微載體基質有玻璃 、 葡聚糖 、纖維素 、 塑料和明膠等 ， 表面帶電基團為 DEAE等 。 懸浮微球使細胞生長的環(huán)境均一 ， 培養(yǎng)基利用率高 ， 重復性好 ， 減少了勞動強度 ， 容易放大 ， 于 20世紀 80年代正式用于工業(yè)化生產干擾素 、 疫苗和尿激酶原等 。 2． 微載體培養(yǎng) 微載體為三維培養(yǎng)系統 ， 細胞貼附于微載體上伸展和增殖 ，再懸浮于培養(yǎng)液中 。 優(yōu)點：容易更換培養(yǎng)液 ， 灌注培養(yǎng)時 ， 能達到高細胞密度；有利于產物的分泌表達 ， 可改變培養(yǎng)液與細胞的比例 。 細胞貼壁原理： 細胞主要靠靜電引力和范德華力貼附在固體表面 ， 因為動物細胞在生理狀態(tài)下帶負電 ， 貼壁培養(yǎng)的固體表面要求具有正電荷和高表面活性 。 貼壁培養(yǎng)容器 :轉瓶 、 玻璃珠 、 微載體和中空纖維等 。 接種后 ， 細胞經過吸附 、 接觸而 貼附于基質表面 ， 然后進行 生長 、 分裂繁殖 ， 很快進入對數期 。 1. 單層貼壁培養(yǎng) 細胞貼附于一定的固體支持表面上 ， 進行的培養(yǎng)方法 。 融化后的細胞可用于進一步實驗 。 復蘇細胞： 冷凍細胞取出 ， 立即在 37℃ 水浴中 ， 快速融化 。分裝 ， 火焰下封口 。 WCB1 QC WCB2 QC QC 原始培養(yǎng)物 MCB QC內容：細胞活性檢測、無菌實驗、核型、DNA分析、同工酶分析、支原體試驗、其他外源物試驗、穩(wěn)定性和基因型分析等，工作細胞庫必須與主細胞庫完全一致。 曾經廣泛應用 ， 但不是理想的生產細胞系 3. 細胞系的建立與保存 一旦獲得了穩(wěn)定的有一定特性的細胞系 ， 就建立細胞庫 ，進行長期保存 。 過程與原代細胞相同 ， 用 30－ 50倍體的 ％ 胰蛋白酶和 EDTA對細胞塊消化 ， 消化后再培養(yǎng) 。 胰蛋白酶：細胞間質較少的軟組織 ，胚胎 、 肝 、 腎及傳代細胞 膠原酶：纖維 、 上皮 、 癌組織 工作濃度： mg/ml 鏈霉蛋白酶 、 粘蛋白酶 、 蝸牛酶 2. 傳代細胞培養(yǎng) 長滿器皿表面的細胞進行分離 ， 接種到新的培養(yǎng)基上 ，進行新一輪培養(yǎng) 。 1. 原代細胞系的分離與培養(yǎng) 用原代細胞系生產藥物需要大量的動物 。 細胞無限傳代 ， 使大規(guī)模工業(yè)化生產藥物成為可能 。 中國倉鼠卵巢細胞 、 小鼠 L929細胞 、 BHK細胞 。 血液 、 淋巴細胞 、 腫瘤細胞和某些轉化細胞屬于此類 ， 生長干擾素的Namalwa細胞 。 貼壁依賴性細胞：生長需要在適量帶電荷的固體或半固體支持表面 ， 細胞自身分泌或人為在培養(yǎng)基中加入貼附因子 ，使細胞依附在支持物表面 ， 才能生長和增殖 ， 大多數動物細胞都屬于此類 。 細胞壽命無限 ， 生長不受細胞密度的影響 ， 倍增時間短不具接觸抑制現象 ， 它對培養(yǎng)條件和生長因子等要求低 ，非常適合于工業(yè)化生產 ， 理想的藥物生產細胞系 。 如腫瘤細胞就是自發(fā)形成的永久細胞系 ， 沒有分裂次數的限制 。 有限細胞系 :正常細胞經過多次傳代后 ， 一般可連續(xù)培養(yǎng)30－ 50代 ， 就會逐漸失去增殖能力 ， 也就是說它們只能生長有限的時間 ， 經過若干傳代培養(yǎng)后將老化死亡 。 如 WI－ 3 MRC－ 2BS等用于生產 。 傳代后 ， 細胞分裂增殖旺盛 ，能保持一致的二倍體核型 ， 所以又成為二倍體細胞系 。 生產中有些產品仍沿用原代細胞 ，如雞胚細胞 ， 兔或鼠腎細胞 、 淋巴細胞 。 體外培養(yǎng)細胞 ， 可分為原代細胞系 、 傳代細胞 。 在胚胎發(fā)育過程中 ， 高等動物細胞的分化是由全能性變成多能性 ， 再變成單能性 ， 進而失去再分化的能力 。 不同細胞具有不同的功能 ， 細胞分化異常導致癌變 。 三 、 群體細胞生長的動力學參數 細胞分裂代數 G就可用下列公式計算： G＝ logN－ logN0） /log2 第四節(jié) 動物細胞的分離與培養(yǎng) 一、細胞的種類 生物體是由多種多樣的分化細胞構成 ， 如人體的細胞類型達 200余種 。 3. 靜止期 ：分裂數與死亡數相等的相對動態(tài)平衡時期 。 2. 對數生長期：細胞分裂旺盛 ， 指數增加 。在培養(yǎng)過程中，缺乏生長因子或血清、營養(yǎng)受限和逆境等可引發(fā)凋亡發(fā)生。 不同的細胞類型其分裂周期及各期的時間都不同，培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基成分也會影響細胞周期 ,一般地動物細胞分裂周期為 12－ 48小時 ,典型的細胞周期為 24小時。 第二節(jié) 動物細胞增殖生長的動力學過程 一、單細胞生長增殖周期 從一個細胞分裂形成兩個新細胞的過程為一個細胞周期或一個細胞世代 。 一般情況下 ， 培養(yǎng)基成分如氨基酸 、 維