基因工程與體外表達(dá)-資料下載頁(yè)
2025-09-11 20:46本頁(yè)面
【正文】 （二）感染（ infection） （三）轉(zhuǎn)染（ transfection） 32 五 、 目的基因的篩選和鑒定 外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞后 ， 篩選含有目的基因的陽(yáng)性克隆并加以擴(kuò)增 。 所用的方法主要有遺傳學(xué)方法 、 免疫學(xué)方法 、 核酸雜交法 、 PCR等 。 33 （ 一 ） 遺傳學(xué)方法 插入滅活法 1. 34 2. 藍(lán) 白篩選 （ α互補(bǔ) ） 許多載體（如 M13系列、 pUC系列、 pGEM系列）都含有 β 半乳糖苷酶基因（ lacZ）的調(diào)控序列和氨基端 145個(gè)氨基酸的編碼序列。這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)。這種載體適用于可編碼 β 半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主細(xì)胞。宿主和載體編碼的片段各自均無(wú)酶活性，但它們可以互補(bǔ)形成具有活性的β 半乳糖苷酶，使人工底物 Xgal轉(zhuǎn)化成藍(lán)色的代謝產(chǎn)物，出現(xiàn)藍(lán)色的菌落。如果在多克隆位點(diǎn)上插入外源 DNA片段，將使 lac Z基因滅活，不能生成有活性的β 半乳糖苷酶，結(jié)果菌落呈現(xiàn)白色。 35 36 37 （ 二 ） 免疫學(xué)方法 如果克隆基因的產(chǎn)物是已知的 ， 并且在菌落或噬菌斑中表達(dá) ， 因而可用相應(yīng)的抗血清或單克隆抗體 ， 通過(guò)放射免疫 、 化學(xué)發(fā)光或顯色反應(yīng)進(jìn)行篩選 。 38 （ 三 ） 核酸雜交法 對(duì)菌斑或菌落進(jìn)行原位分子雜交是從基因組文庫(kù)、 cDNA文庫(kù)或重組質(zhì)粒中篩選目的基因的最有效的方法之一，而且這種篩選不取決于目的基因是否表達(dá)。 39 菌落原位雜交的原理 轉(zhuǎn)化 E. coli并鋪于瓊脂平板上 將膜放置 平板表面 定位、揭起 變性、 中和、 固定 雜交、 洗膜、 顯影 40 （ 四 ） PCR技術(shù) 具有高度的靈敏度和特異性，能在極短的時(shí)間內(nèi)將目的基因擴(kuò)增至數(shù)百萬(wàn)倍，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，可直接觀察到產(chǎn)物的存在。 41 (五 ) 酶切鑒定 用抗生素篩選 、 藍(lán)白篩選等方法篩選出的菌落需進(jìn)一步進(jìn)行酶切分析 ， 鑒定插入片段的大小和插入方向 。
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