【正文】 酚：氯仿：異戊醇 ＝ 25： 24： 1 酚：氯仿 ＝ 1： 1 ? 乙醇或異丙醇沉淀 DNA DNA 溶液中的鹽離子中和 DNA分子上的磷酸根，導(dǎo)致 DNA 分子在乙醇或異丙醇中沉淀出來，達(dá)到濃縮 DNA 的目的。 倍體積的乙醇 1 倍體積的異丙醇 DNA 的純化與濃縮 常用的鹽溶液 鹽類 儲(chǔ)存液 (M) 終濃度 (M) 醋酸鈉 醋酸銨 氯化鋰 氯化鈉 注：需用 70％ 乙醇洗滌 DNA 沉淀以除去 DNA 中 的鹽離子。 質(zhì)粒 DNA 的制備過程 大腸桿菌的生長 質(zhì)粒的提取 質(zhì)粒的鑒定 ? 生長滯后期 適應(yīng)期，細(xì)菌生長緩慢 ? 對(duì)數(shù)期 在豐富的培養(yǎng)基中，大腸桿菌在 20 30 分鐘內(nèi)復(fù)制 一代。 ? 飽和期 (平臺(tái)期 ) 培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分和氧耗盡，培養(yǎng)基中的細(xì)菌代謝 產(chǎn)物達(dá)到抑制細(xì)菌快速生長的濃度；細(xì)菌密度為 1 X 109 2 X 109 細(xì)胞 /ml LB 培養(yǎng)基 大腸桿菌的生長 收獲細(xì)菌 將菌體懸浮在溶液 I (50 mM TrisCl, pH 。 10 mM EDTA。 100 ?g/ml RNase A) 中 加溶液 II (200 mM NaOH。 1% SDS)， 5 分鐘 加溶液 III (3 M KAc, pH ) 離心后取上清 , 加入等體積的酚 /氯仿 /異戊醇 離心后取水相 , 加 離心后得到 DNA 沉淀 , 用 70％乙醇洗滌 DNA 沉淀 空氣干燥 DNA 沉淀 , 將 DNA 溶解在 TE (10 mM TrisCl, pH 。 1 mM EDTA, pH ) 或 ddH2O 中 質(zhì)粒的提取 (1) OD260/OD280 值 OD260： 測定質(zhì)粒 DNA 在 260 nm時(shí)的光吸收值 OD280： 測定質(zhì)粒中所污染的蛋白質(zhì)在 280 nm 時(shí)的光吸收值 OD260/OD280 值表示質(zhì)粒的純度 : 當(dāng) OD260/OD280 ? 時(shí)表示質(zhì)粒較純。 質(zhì)粒 DNA 濃度 = OD260 x 50 ?g/ml x 稀釋倍數(shù) 質(zhì)粒的鑒定 DNA/RNA 電泳 (DNA/RNA Electrophoresis) 電泳 (electrophoresis) 帶電荷物質(zhì)在電場中移 動(dòng)的現(xiàn)象叫電泳。 ? DNA 或 RNA分子帶負(fù)電荷，在電場作用下， DNA 或 RNA 分子由負(fù)極向正極移動(dòng)。 ? DNA 或 RNA 分子量越大，遷移速率越慢，反之， 分子量越小，遷移速率快。 ? 不同構(gòu)象的 DNA 或 RNA 分子，遷移速率不同。 DNA 或 RNA 電泳原理 ? 用 瓊脂糖凝膠電泳分離、鑒定和純化 DNA 分子 ? 用變性瓊脂糖凝膠電泳分離和鑒定 RNA 分子 ? 用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離 DNA 測序反應(yīng)中 合成的系列單鏈 DNA 片段 (5500 bp) 核酸電泳類型 － ＋ ～ V ～ mA ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 遷移方向 電泳儀 樣品槽 負(fù)極 正極 電泳緩沖液 水平電泳槽 瓊脂糖凝膠槽 ? 瓊脂糖 (agarose) 是 D 和 L半乳糖殘基通過 ?(1?3) 和 ?(1?4) 糖苷鍵交替構(gòu)成的線狀聚合物，瓊脂糖凝膠 可形成孔徑為 50 nm 到 200 nm 的分子篩。 ? 瓊脂糖凝膠的分辨率較低，但分離范圍較大。 DNA 瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖凝膠濃度與線狀 DNA 分子的有效分離范圍 瓊脂糖凝膠濃度 (%) 線狀 DNA 分子的有效分離范圍 (kb) 30 → 12 → 10 → 7 → 3 → 常用電泳緩沖液 緩沖液 工作液 儲(chǔ)存液 /LT A E 1 X 5 0 X4 0 mM T r is 乙酸 2 4 2 g T ri s1 mM EDT A 5 7 .1 ml 冰乙酸1 0 0 m l 0 . 5 M EDT A (p H )TBE 0 .5 X 1 0 X4 5 mM T r is 硼酸 1 0 8 g T ri s1 mM EDT A 5 5 g 硼酸4 0 ml 0 .5 M EDT A ( pH 8 .0 )TPE 1 X 1 0 X9 0 mM T r is 磷酸 1 0 8 g T ri s2 mM EDT A 1 5 .5 ml 磷酸4 0 ml 0 .5 M EDT A ( pH 8 .0 )6X 樣品緩沖液 ％ 溴酚藍(lán) ％ 二甲苯氰 FF 40％ 蔗糖 (1) 溴酚藍(lán)和二甲苯氰 FF 在電場中向正極移動(dòng)，用來預(yù)測 DNA 樣品的電泳情況。在 TBE瓊脂糖凝膠電泳中 : 溴酚藍(lán) ~ 300 bp 的線狀雙鏈 DNA 二甲苯氰 FF ~ 4000 bp 的線狀雙鏈 DNA (2) 蔗糖可以增加樣品密度以保證 DNA 沉入加樣孔內(nèi)。 樣品緩沖液 NH2 C2 H5 H2N N+ Br 溴化乙錠 (Ethidium bromide, EB) EB/ 堿基 瓊脂糖凝膠中 DNA 的檢測 EB 染色方法 EB 終濃度： ?g/ml (1) 將 EB 直接加入瓊脂糖凝膠中染色。 便于觀察 DNA 的電泳情況，但 EB 嵌入 DNA 分子 后， 會(huì)改變 DNA 分子的遷移速率 。 (2) 電泳結(jié)束后將瓊脂糖凝膠浸入 EB 染色液中染色。 注意： EB 是潛在的 致癌劑 ，須小心操作。 SYBR (綠色熒光染料 ) ? 安全性高； ? 敏感性是 EB 的 2 倍； ? 用于 DNA 和 RNA 的染色； ? 檢測方便 激發(fā)光波長： 280 nm 和 502 nm 發(fā)射光波長： 530 nm 可用紫外光透射儀、可見光透射儀或激光掃描儀檢測 。 二甲苯氰 FF 溴酚藍(lán) 凝膠電泳成象結(jié)果 線狀 DNA (Linear DNA, L) 超螺旋 DNA (Supercoiled DNA, SC) 帶缺口的閉環(huán) DNA (Opened circular DNA, OC) 閉環(huán) DNA (Closed circular DNA) (2) 質(zhì)粒的電泳 加樣孔 OC L SC 5 kb 4 kb 850 bp 3 kb 1 kb 2 kb kb 650 bp 500 bp pUC18 質(zhì)粒 DNA ? 為防止單鏈 RNA 形成空間結(jié)構(gòu)，需用變性的瓊脂糖 凝膠即甲醛 瓊脂糖凝膠分離 RNA分子。 ? 為防止外源性 RNase 的污染，所用的托盤、梳子、 倒膠槽、電泳槽等需要用焦碳酸二乙酯 (DEPC) 或 H2O2處理；所用的緩沖液要用 DEPC 處理的 ddH2O 來配制。 注意： DEPC是潛在的致癌劑 ，須小心操作。 RNA 瓊脂糖凝膠電泳 1． 10X MOPS 電泳緩沖液 200 mM MOPS [3(嗎啉代 )丙磺酸 ], pH 50 mM NaAc 10 mM EDTA, pH 使用前，將 10X MOPS 稀釋至 1X MOPS 2． 甲醛 瓊脂糖凝膠的制備 甲醛的終濃度： ％ 3． 電泳前 RNA 樣品的處理 用 甲醛和甲酰胺等 處理 RNA 樣品以 打開的 RNA 發(fā) 夾結(jié)構(gòu) 4． 電泳結(jié)束后 用 EB 染色液染色。 ? 聚丙烯酰胺凝膠的分辨率較高，所以聚丙烯酰胺凝 膠電泳用于分離 DNA 測序反應(yīng)中的系列 DNA 片段。 ? 在聚丙烯酰胺凝膠中加入了尿素作為變性劑，以確 保 DNA 片段保持單鏈狀態(tài)并以線狀 DNA分子的形 式泳動(dòng)。 ? 所用的電泳緩沖液為 1X TBE。 ? 大型垂直板電泳 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (Polymerase Chain Reaction) 一 . PCR 的基本原理 根據(jù)細(xì)胞分裂中 DNA 半保留復(fù)制 機(jī)理在體外快速擴(kuò)增某一特定 DNA 片段的方法。 PCR工作原理 ? 是以 要擴(kuò)增的 DNA分子為 模板 ，以 一對(duì)分別與模板 5`末端和 3`末端相互補(bǔ)的寡核甘酸片段為 引物 、在 4種 脫氧核糖核甘酸存在的條件下 ，依賴 DNA聚合酶 的 酶促合成反應(yīng) 。 PCR特異性 取決于人工合成的一對(duì)引物和模板 DNA結(jié)合的特異性 。 PCR體系基本組成 ? 模板 DNA： （ 1025） 拷貝 ? dNTP底物 ： 20— 200umol/L， 過高將加快反應(yīng)速度 ， 同時(shí)增加堿基的錯(cuò)誤摻入率 ? 特異性引物： — umol/L ? DNA聚合酶： Klenow T4 、 T7聚合酶 TaqDNA聚合酶 具有良好的熱穩(wěn)定性 。 并具有 5`3`聚合酶活性及 3`5`外切酶活性 ， 因此可以校正 PCR反應(yīng)中某些單核甘酸的錯(cuò)配 。 ? 含 Mg2+的緩沖液 ： Mg2+ 能影響反應(yīng)特異性和擴(kuò)增片段的產(chǎn)率，一般為— ， 過量將增加非特異性條帶的產(chǎn)生。 循環(huán)次數(shù)取決于模板 DNA的濃度 30次 — 擴(kuò)增 100萬倍 引物設(shè)計(jì)原則 ? 引物 長度 1530bp ? 引物 堿基 盡可能 隨機(jī)分布 ， 避免出現(xiàn)嘌呤 、 嘧啶堆積現(xiàn)象 ， 引物 G+C含量宜在 4555%左右 。 ? 引物的 內(nèi) 部 不應(yīng)形成二級(jí)結(jié)構(gòu) ， 兩個(gè) 引物間不應(yīng)有互補(bǔ)鏈存在 ? 引物的堿基順序不應(yīng)與非擴(kuò)增區(qū)域有同源性 。計(jì)算機(jī)分析 。 ? 引物 3`末端堿基原則上與模板配對(duì) ， 3`末端堿基最好不是 A。 ? 引物 5`末端 堿基無嚴(yán)格限制 ， 只要與模板 DNA結(jié)合的引物長度足夠 ， 末端 可以游離 。 因此可以在引物 5`末端加上限制性內(nèi)切酶位點(diǎn) 。 Tm = + (%G + C) PCR產(chǎn)物的檢測 ? 瓊脂糖凝膠電泳； （ EB） ? 分子雜交； ? 限制性內(nèi)切酶酶切分析； ? 微孔板夾心雜交法； ? 直接測序 反轉(zhuǎn)錄 PCR (RTPCR) RTPCR 將以 RNA 為模板的 cDNA 合成同 PCR 結(jié)合在一起，提供了一種分析基因表達(dá)的快速靈敏的方法。 5’ 3’ AAAAA 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 539。 3’ 339。 5’ 5’ 3’ RTPCR 原理 mRNA 1st cDNA 逆轉(zhuǎn)錄酶、 下游引物、 dNTPs Taq DNA聚合酶 、 上游及下游引物、 dNTPs 5’ 5’ 3’ 3’ 特異 PCR 產(chǎn)物 5’ 5’ 3’ 3’ 經(jīng) 30 個(gè)循環(huán)，產(chǎn)生 230 個(gè)分子拷貝 5’ 5’ 3’ 3’ PCR 技術(shù)的應(yīng)用 1. 基礎(chǔ)研究 (1) 基因或 cDNA 克?。簭幕驍?shù)據(jù)庫中獲得某一基因或 cDNA 的核 苷酸序列，用 PCR 方法擴(kuò)增并克隆該基因或 cDNA。 (2) 基因表達(dá)：用 RTPCR檢測某一特定基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。 2. 醫(yī)學(xué) (1) 感染性疾病病原體的診斷： HIV、 結(jié)核分枝桿菌、乙肝病毒等。 (2) 遺傳病相關(guān)基因的檢測：鐮刀型細(xì)胞貧血、血友