[理學(xué)]如何做好酶切-資料下載頁
2025-08-17 03:34本頁面
【正文】 裝前的Mix，要求放在冰里，盡快使用。 3．如何設(shè)定PCR引物的保護(hù)堿基？ 如果您想直接對(duì)PCR產(chǎn)物酶切，同時(shí)想獲得理想的酶切效果，一般情況下需要在酶切位點(diǎn)序列5’端方向增加額外的保護(hù)堿基。保護(hù)堿基的數(shù)目隨酶的種類不同而不同，根據(jù)文獻(xiàn)資料匯總，一般保護(hù)堿基有34個(gè)就可以了。不提倡提供過多的保護(hù)堿基，因?yàn)樘嗟念~外堿基會(huì)增加PCR擴(kuò)增的難度，同時(shí)增加合成費(fèi)用。 4．如何對(duì)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行酶切？ Fermentas公司的研究表明，限制性內(nèi)切酶在 PCR擴(kuò)增體系中仍然有部分活性，可以通過稀釋（3倍以上）擴(kuò)增混合液，適當(dāng)提高酶量和反映時(shí)間，進(jìn)行酶切。我個(gè)人認(rèn)為需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切分析通常是為了或基因表型分析，由于Taq，Pfu等高溫聚合酶在酶切溫度（37度或更高）下，仍然保持一定的活性，高溫聚合酶所具有的聚合或無模板添A或外切修正的功能仍在一定的程度上表現(xiàn)出來，可能會(huì)影響到酶切產(chǎn)物末端的正確性。結(jié)果是要么裝不上去，要么裝上去切不下來，測(cè)序發(fā)現(xiàn)末端引物堿基少了。正確安全的做法是先通過瓊脂糖電泳回收產(chǎn)物，然后酶切，酶切可以適當(dāng)提高酶的用量。一般的做法是從50ulPCR反應(yīng)中回收的產(chǎn)物，溶解于45ul水中，加入酶，酶切后的產(chǎn)物通過從溶液中回收DNA的方式直接回收，不需要跑瓊脂糖電泳。
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