[理學(xué)]如何做好酶切(文件)
【正文】 基化敏感，還需要用Dcm, ，這種情況是很少發(fā)生。對(duì)超螺旋狀DNA完全酶切所需要的酶量要比線狀的高好幾倍(在我們的目錄上有部分酶是有標(biāo)注的)，同時(shí)需要提高酶的用量（10U/ug）和延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間等措施。 4) 甲基化程度對(duì)酶的活性是否有影響：細(xì)菌中主要有Dcm和Dam兩種甲基化方式，在植物和動(dòng)物細(xì)胞中主要是CG位被甲基化。注意有些研究人員將buffer長(zhǎng)時(shí)間放在4度或室溫，這是很不規(guī)范的行為。這種提前混合的做法沒(méi)有問(wèn)題，只是動(dòng)作要快一些，沒(méi)有分裝前的Mix，要求放在冰里，盡快使用。 4．如何對(duì)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行酶切？ Fermentas公司的研究表明，限制性內(nèi)切酶在 PCR擴(kuò)增體系中仍然有部分活性，可以通過(guò)稀釋（3倍以上）擴(kuò)增混合液，適當(dāng)提高酶量和反映時(shí)間，進(jìn)行酶切。一般的做法是從50ulPCR反應(yīng)中回收的產(chǎn)物，溶解于45ul水中，加入酶，酶切后的產(chǎn)物通過(guò)從溶液中回收DNA的方式直接回收，不需要跑瓊脂糖電泳。結(jié)果是要么裝不上去，要么裝上去切不下來(lái)，測(cè)序發(fā)現(xiàn)末端引物堿基少了。保護(hù)堿基的數(shù)目隨酶的種類不同而不同，根據(jù)文獻(xiàn)資料匯總，一般保護(hù)堿基有34個(gè)就可以了。通常是將緩沖、酶和適量的水配制成一個(gè)混合物，然后分裝，最后加模板。 5) 反應(yīng)條件是否合適：對(duì)照說(shuō)明書(shū)，檢查使用的溫度是否正確，
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