[理學(xué)]如何做好酶切(完整版)
【正文】 切一般要維持在1050ul，酶切鑒定1020ul就可以了。一般反應(yīng)都用37度，但是 Sma I 的最適合溫度是25度，37度時(shí)酶仍表現(xiàn)出活性，但是效率下降50%。 2．如果遇到酶切不動(dòng)或切不完全，該怎么辦？ 要回答這么問(wèn)題常常需要了解酶活性單位是如何確定，我們多次接到這樣的問(wèn)題：1個(gè)單位的酶能在60分鐘內(nèi)切1ug的DNA,為什么我們的DNA那么少切那么長(zhǎng)時(shí)間也不能切開或切完全？ 從下面幾個(gè)因素去考慮： 1) 酶是否有活性：酶的活性單位通常是在60分鐘酶切1ug lambda DNA或特定線狀DNA所需要的酶量。對(duì)超螺旋狀DNA完全酶切所需要的酶量要比線狀的高好幾倍(在我們的目錄上有部分酶是有標(biāo)注的)，同時(shí)需要提高酶的用量（10U/ug）和延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間等措施。注意有些研究人員將buffer長(zhǎng)時(shí)間放在4度或室溫，這是很不規(guī)范的行為。 4．如何對(duì)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行酶切？ Fermentas公司的研究表明，限制性內(nèi)切酶在 PCR擴(kuò)增體系中仍然有部分活性，可以通過(guò)稀釋（3倍以上）擴(kuò)增混合液，適當(dāng)提高酶量和反映時(shí)間，進(jìn)行酶切。結(jié)果是要么裝不上去，要么裝上去切不下來(lái)，測(cè)序發(fā)現(xiàn)末端引物堿基少了。通常是將緩沖、酶和適量的水配制成一個(gè)混合物，然后分裝，最后加模板。 3) 模板純度是否夠：模板
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