[理學(xué)]如何做好酶切-文庫吧
2025-08-02 03:34 本頁面
【正文】 高，溶液黏度過大，酶不能有效擴(kuò)散，酶切效果不會(huì)好。濃度過低，也會(huì)影響酶活性。6) 注意模板用量和反應(yīng)體積的關(guān)系。對(duì)酶用量，模板用量，反應(yīng)體積等要素的確定需要的是時(shí)間和經(jīng)驗(yàn)的積累。7) 酶切反應(yīng)的各個(gè)組分加完后，需要用TIP小心混勻幾次，short spin 一下就可以保溫了。一般不能使用振蕩器混勻。8) 反應(yīng)溫度的選擇。一般反應(yīng)都用37度，但是 Sma I 的最適合溫度是25度，37度時(shí)酶仍表現(xiàn)出活性，但是效率下降50%。部分從耐熱菌制備的酶需要在37度以上的溫度反應(yīng)，如Taq I的最適溫度為65度，37度保溫，效率僅為前者的1/10。9) 反應(yīng)時(shí)間的選擇。一般酶切鑒定30分鐘就可以了。要完全酶切可以采用少量的酶長時(shí)間反應(yīng)，或較高的酶量短時(shí)間處理都可以達(dá)到。在使用高酶量的時(shí)候需要注意甘油的最終濃度不要超過5%，也就是說10ul的體系，酶的用量不要超過1ul。10) 是否和如何終止反應(yīng)？酶切鑒定之類的實(shí)驗(yàn)不需要特殊處理。滅活的手段：加入高濃度的EDTA；65度或80度熱處理2030分鐘；部分從高溫菌純化出來的內(nèi)切酶由于最適的反應(yīng)溫度比較高，熱處理滅活不一定完全，需要用苯酚/氯仿/乙醇方法純化；電泳回收也是實(shí)驗(yàn)室常用除酶的手段。 2．如果遇到酶切不動(dòng)或切不完全，該怎么辦？ 要
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