【正文】 ) 更離不開菌種，因此菌種是國家的重要資源，菌種保藏是進行微生物學研究和微生物育種工作的重要組成部分。 ? 菌種保 藏目的 第三節(jié) 生產(chǎn)菌種的保藏與復壯 ① 保持優(yōu)良生產(chǎn)性能的穩(wěn)定 ② 不污染雜菌 ③ 不死亡 71 菌種保藏的原理： ? 菌種保藏主要是根據(jù)菌種的 生理、生化特性 ，人工創(chuàng)造條件，如 低溫、干燥、隔絕空氣或氧氣、缺乏營養(yǎng)物質(zhì) 等，使孢子或菌體的生長代謝活動盡量降低，使 菌種處于“休眠”狀態(tài) (孢子、芽孢等 ) ，抑制其繁殖能力，以減少其變異，達到長期保存的目的。 ? 好的保藏方法，應能 保持菌種優(yōu)良特性 和 較高存活率 ，同時也應考慮到方法本身的 經(jīng)濟、簡便 。 72 幾種常用菌種保藏方法 方法名稱 主要措施 適宜菌種 保藏期 評價 斜面低溫 保藏法 低溫 4℃ 各大類 1~3月 簡便 液體石蠟 封存法 低溫 4℃ 、缺氧 各大類 1~2年 簡便 固體曲 保藏 法 低溫或室溫，干燥 霉菌 放線菌 1~3年 簡便 沙土管 保藏 法 低溫 4℃ 、干燥、無營養(yǎng) 產(chǎn)孢子菌 1~10年 簡便 有效 冷凍干燥 保藏 法 干燥、無氧、低溫 20 ℃ 、有保護劑 各大類 5~15年 簡便 有效 液氮超低溫保藏 法 無氧、超低溫 150 ℃ 、有保護劑 各大類 永久保存 簡便 有效 73 菌種保藏的注意事項 （ 1）菌種在保藏前所處的狀態(tài) ? 菌種斜面的培養(yǎng)時間和培養(yǎng)溫度影響其保藏質(zhì)量。培養(yǎng)時間過短，保存時容易死亡，培養(yǎng)時間長，生產(chǎn)性能衰退。 ? 一般以稍低于生長最適溫度培養(yǎng)至孢子成熟的菌種進行保存，效果較好。 74 （ 2）菌種保藏所用的基質(zhì) ? 培養(yǎng)基，碳源比例應少些，營養(yǎng)成分貧乏些較好，否則易產(chǎn)生酸，或使代謝活動增強，影響保藏時間。 ? 砂土管保藏需將砂和土充分洗凈，以防其中含有過多的有機物，影響菌的代謝或經(jīng)滅菌后產(chǎn)生一些有毒的物質(zhì)。 ? 冷凍干燥所用的保護劑，有不少經(jīng)過加熱就會分解或變性的物質(zhì)，如還原糖和脫脂乳，過度加熱往往形成有毒物質(zhì)，滅菌時應特別注意。 75 （ 3）操作過程對細胞結(jié)構(gòu)的損害 ? 冷凍干燥時，凍結(jié)速度緩慢易導致細胞內(nèi)形成較大的冰晶，對細胞結(jié)構(gòu)造成機械損傷。 ? 真空干燥程度也將影響細胞結(jié)構(gòu)，加入 保護劑 就是為了盡量減輕冷凍干燥所引起的對細胞結(jié)構(gòu)的破壞。 76 二、菌種的復壯 ? 菌種衰退： 菌種經(jīng)過長期人工培養(yǎng)或保藏，由于自發(fā)突變的作用而引起某些優(yōu)良特性變?nèi)趸蛳У默F(xiàn)象 稱為菌種衰退。 常見的衰退現(xiàn)象： ? 菌落和細胞形態(tài)的改變； ? 生長速度緩慢，產(chǎn)孢子越來越少； ? 抵抗力、抗不良環(huán)境能力減弱等。 ? 代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對宿主寄生能力下降； 77 ? 衰退的原因： ? (1)基因突變； ? 菌種退化的主要原因是有關基因的負突變。如果控制產(chǎn)量的基因發(fā)生負突變則會引起產(chǎn)量下降，如果控制孢子生成的基因發(fā)生負突變則孢子性能就會下降。當然，這些負突變都是自發(fā)形成的。經(jīng)常處于旺盛生長狀態(tài)的細胞比休眼狀態(tài)細胞發(fā)生突變的機率大得多。 ? 很多抗生素生物合成、產(chǎn)生氣生菌絲和色素等性狀都部分或全部受質(zhì)?；蚩刂?。當菌株連續(xù)傳代、菌體發(fā)生質(zhì)粒脫落而出現(xiàn)大量光禿型菌落，則生產(chǎn)能力也顯著下降。 78 ? (2)變異菌株性狀分離； ? 誘變的單菌落是由一個以上孢子或細胞形成； 誘變育種時，所得到的優(yōu)良菌株的單菌落是由一個以上孢子或細胞形成。 ? 菌落由一個孢子或單個細胞形成，但它是多核細胞； ? 單核孢子發(fā)生突變時，雙鏈 DNA上僅一條鏈上某個位點發(fā)生變化； 79 ? (3)連續(xù)傳代 ? 連續(xù)傳代也是菌種退化的直接原因。個別細胞性狀改變不足以引起菌種退化，經(jīng)多次傳代，退化細胞在數(shù)量上占優(yōu)勢，于是退化性狀表現(xiàn)逐步明朗化，最終成為一株退化菌株。 ? 產(chǎn)腺苷的黃嘌呤缺陷型菌株在接種傳代過程中產(chǎn)量和回復子數(shù)量間的關系 80 產(chǎn)腺苷的黃嘌呤缺陷型菌株在接種傳代過程中 產(chǎn)量和回復子數(shù)量間的關系 實驗 移接代數(shù) 每代斜面保存時間（天） 回復子比數(shù) 106 腺苷產(chǎn)量 g/L 1 2 3 4 5 6 0 2 6 7 9 12 147 133, 14 47, 3, 9, 3, 71, 14 47, 3, 9, 3, 13, 58, 14 47, 3, 9, 3, 13, 8, 3, 47, 4 47, 3, 9, 3, 13, 8, 3, 4, 14, 6, 6, 31 1/ 1/ 1/ 1/ 1/ 1/ 由上表可見，雖菌種總的保存時間都是 147天，但隨著移植代數(shù)的增加，回復突變率也增加，腺苷產(chǎn)量下降。這也說明，退化并不突然明顯，而是當退化細胞在繁殖速率上大于正常細胞時，每移植一代，使退化細胞的優(yōu)勢更為顯著，從而導致退化。 81 ? (4)其它因素 ? 菌種保藏不當； ? 生長條件不滿足（培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)條件）。 ? 如溫度、濕度、培養(yǎng)基成分及各種培養(yǎng)條件都會引起菌種的基因突變。例在保藏菌種中基因突變率就隨溫度降低而減少，又例在產(chǎn)腺苷的黃膘吟缺陷型中，若在培養(yǎng)基中加入黃嘌呤、鳥嘌呤及組氨酸和蘇氨酸可降低回復突變的數(shù)量。 82 防止菌種衰退的方法 ①控制傳代次數(shù) （一般在 DNA的復制過程中，堿基的錯配率是 5x104，自發(fā)突變的頻率為 108 ~109，采用良好的菌種保藏方法，可以減少移種和傳代的數(shù)） ； ②選擇合適的培養(yǎng)條件； ③采用不同類型的細胞進行傳代 （對絲狀微生物而言，通常采用穩(wěn)定的單核孢子進行接種） ； ④采用有效的菌種保藏方法。 ⑤分離復壯 83 菌種的復壯： ? 狹義的復壯 ： 是指在菌種已發(fā)生衰退的情況下，通過純種分離和生產(chǎn)性能測定等方法，從衰退的群體中找出未衰退的個體，以達到恢復該菌原有典型性狀的措施。 ? 廣義的復壯 ： 是指在菌種的生產(chǎn)性能未衰退前就有意識的經(jīng)常進行純種的分離和生產(chǎn)性能測定工作，以期菌種的生產(chǎn)性能逐步提高。實際上是利用自發(fā)突變（正變）不斷地從生產(chǎn)中選種。 ? 復壯措施有三： 選 優(yōu) 汰 劣 84 ? (1)純種分離 ? 采用自然分離的方法，把衰退菌種的細胞群體中一部分仍保持原有典型性狀的單細胞分離出來，通過擴大培養(yǎng)可以恢復菌種的原有性狀。 ? (2)淘汰衰退的個體 ? 如 芽孢產(chǎn)生菌經(jīng)高溫 (80 ℃ )處理，則不產(chǎn)芽孢的個體被淘汰。 ? (3)選擇合適的培養(yǎng)條件 ? 一般來說將保藏后的菌種接種在保藏前所用的同一培養(yǎng)基上，有利于菌種原有性狀的恢復。 85 本章思考題 ? 種子擴大培養(yǎng)：種齡：接種量；菌種衰退： ? 種子制備一般包括哪兩個過程？ ? 種子質(zhì)量主要受哪些因素的影響？ ? 種子異常的表現(xiàn)。 ? 一般衰退菌種的主要復壯措施。 ? 在絲狀菌液體發(fā)酵的過程中容易產(chǎn)生菌絲團的原因？ ? 為了加大接種量，維持正常生產(chǎn)，常采用哪些方法。 ? 種子質(zhì)量的優(yōu)劣，主要取決于哪幾個方面。 ? 生產(chǎn)中，種子生長、代謝緩慢的主要原因。 86 對數(shù)生長期，菌體量尚未達到最高峰時移種？接入種齡過早、過老的種子會有哪些害處？ 2. 培養(yǎng)基是影響種子質(zhì)量的主要因素之一，為了保證種子質(zhì)量，對培養(yǎng)基有何要求？ 3. 以大接種量和豐富培養(yǎng)基作為高產(chǎn)措施，大接種量有哪些好處？接種量過大、過小又有哪些弊端？ ？