博士生基因工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)試題-資料下載頁
2025-08-05 20:53本頁面
【正文】 義（5分）、研究?jī)?nèi)容與步驟（8分）及預(yù)期結(jié)果（2分），同時(shí)簡(jiǎn)要說明在研究過程中可能遇到的最主要的技術(shù)難題或取得研究成功的關(guān)鍵因素（5分）。一：研究目的及意義 梨是我國重要的果樹作物，栽培品種十分豐富，產(chǎn)量居全世界第一。其中白梨、砂梨、秋子梨都原產(chǎn)我國。近年來，由于花色苷作為一種生物活性物質(zhì)得到廣泛研究，它使果實(shí)表皮（如蘋果、葡萄、荔枝）呈現(xiàn)紅色、紫色等，對(duì)人體也具有防輻射，防心腦血管疾病等重要作用。紅梨作為一種特別的果樹資源，因其紅色果皮被研究者逐漸重視起來。許多關(guān)于紅梨的果皮中花色苷的研究被相繼報(bào)道。包括其合成途徑中各個(gè)結(jié)構(gòu)基因及調(diào)節(jié)這些結(jié)構(gòu)基因協(xié)同表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子也基本明確。早酥梨是我國廣泛栽培的一個(gè)白梨品種，其果皮為綠色，而2004年在陜西渭南發(fā)現(xiàn)了一個(gè)早熟梨的紅色芽變，該芽變形成的梢和葉片及果皮均為紅色，并命名為‘早酥紅’。在隨后的嫁接苗中發(fā)現(xiàn)了返綠的現(xiàn)象，命名為‘早酥綠’。本實(shí)驗(yàn)擬以三個(gè)材料的葉片及成熟時(shí)期的果實(shí)的果皮為材料，研究紅色突變發(fā)生的位點(diǎn)，為我國紅梨育種及花色苷研究提供參考。二：研究?jī)?nèi)容與步驟研究?jī)?nèi)容：依據(jù)近幾年果皮顏色變化研究相關(guān)的成果，如2004年發(fā)表在science上的紅葡萄變?yōu)榘灼咸咽怯捎谔崛≡缢?、早酥紅、早酥綠三個(gè)材料的RNA，對(duì)三個(gè)材料中花色苷合成過程中的結(jié)構(gòu)基因CHS,CHI,F3H,DFR,UFGT及各轉(zhuǎn)錄因子MYBMYB1bHLHbHLH33等進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析。用葉片提取三個(gè)材料的DNA，克隆其MYB10轉(zhuǎn)錄因子的序列，包括編碼區(qū)序列及啟動(dòng)子序列。分析序列是否存在插入或缺失。然后利用甲基化PCR檢測(cè)在啟動(dòng)子區(qū)域是否存在較明顯的GpC島，造成表型的變化。研究步驟： ，早酥紅，早酥綠三個(gè)材料的葉片和果皮，其中果皮材料為同一材料的十個(gè)果實(shí)的果皮的混合。 ，對(duì)其花色苷進(jìn)行定量。 ，利用三個(gè)材料的葉片提取DNA。 。 ，以葉片DNA為模板分離三個(gè)材料的MYB10的編碼區(qū)和啟動(dòng)子序列。 。 。 ，分離及MYB10的啟動(dòng)子，分析是否這些差異存在普遍性。 預(yù)期結(jié)果：1. 獲得三個(gè)材料的MYB10序列，包括編碼區(qū)和啟動(dòng)子區(qū)，并分析得到其變異區(qū)段或甲基化程度差異。2. 通過查找其他結(jié)構(gòu)基因的序列或啟動(dòng)子序列變異找出紅色芽變的原因。3. 找出變異位置后，與其他紅梨及綠梨比較發(fā)現(xiàn)普遍差異。 擬解決的關(guān)鍵問題：1. 克隆獲得準(zhǔn)確的MYB10的編碼區(qū)和啟動(dòng)子序列。因?yàn)镻CR擴(kuò)增及測(cè)序均可能造成序列間的單堿基差異，需確定差異是來自變異還是來自客觀條件。2. 證明芽變來至于MYB10的結(jié)構(gòu)變異或者其他的花色苷合成相關(guān)基因的變異。3. 找到紅梨和綠梨的普遍差異，為我國紅梨育種提供參考。
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