基因工程簡(jiǎn)答題總結(jié)-資料下載頁
2025-08-05 20:45本頁面
【正文】 和Hind III 雙酶切割基因組DNA 和表達(dá)載體DNA，這種切割可將基因組DNA 片段定向克隆入表達(dá)載體?！?四、問答題1．構(gòu)建表達(dá)載體應(yīng)注意些什么？答：(1) 構(gòu)建表達(dá)載體的關(guān)鍵是用于表達(dá)克隆序列的啟動(dòng)子類型，如果目的是基因的高效表達(dá)，就要選用強(qiáng)的啟動(dòng)子；如果表達(dá)產(chǎn)物對(duì)寄主細(xì)胞有毒性，可選擇弱的啟動(dòng)子，最好使用可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，使在一定的條件下表達(dá)。(2)表達(dá)載體還應(yīng)具有以下組成元件：①攜帶能在寄主細(xì)胞中維持的復(fù)制的起始點(diǎn)。②具有抗生素選擇標(biāo)記或其他選擇機(jī)制。③在緊接啟動(dòng)子的下游安排限制性位點(diǎn)，用于插入需表達(dá)的基因。④具有單一的酶切位點(diǎn)來克隆基因，克隆位點(diǎn)應(yīng)位于準(zhǔn)確的位置，以使克隆基因有效表達(dá)。3．插入失活法和插入表達(dá)法篩選重組體的主要差別是什么？答：主要差別是：(1) 插入失活法是直接根據(jù)失活基因的表型變化來篩選重組體。(2) 插入表達(dá)法是根據(jù)一個(gè)基因的失活引起另一個(gè)基因的表達(dá)表型來選擇。 4．一個(gè)攜帶有氨芐和卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒被僅在卡那霉素基因中有識(shí)別位點(diǎn)的EcoR I 消化。消化物與酵母DNA 連接后轉(zhuǎn)化對(duì)兩種抗生素都敏感的E. coli 菌株。(1) 利用哪一種抗生素抗性選擇接受了質(zhì)粒的細(xì)胞？(2) 怎樣區(qū)分接受了插入酵母DNA 的質(zhì)粒的克?。刻崾荆?1) 選擇Ampr的轉(zhuǎn)化子；(2) 所需的克隆是Ampr和Kans。任何能夠抗這兩種藥物的克隆都是自連的非重組質(zhì)粒。5．用EcoR I 和Hind III 分別切割同一來源的染色體DNA，并進(jìn)行克隆。在前者的克隆中篩選到A 基因，但在后者的克隆中未篩選到A 基因，請(qǐng)說明原因。提示：因?yàn)镠indH I 的切點(diǎn)位于A 基因內(nèi)。 7．用一限制性內(nèi)切核酸酶切割Lac+ Tetr的質(zhì)粒載體，已知該酶識(shí)別的是4 個(gè)堿基序列，并產(chǎn)生有兩個(gè)堿基突出的單鏈末端，該酶在lac 基因內(nèi)有切割位點(diǎn)，并在第二個(gè)氨基酸密碼子內(nèi)，該位點(diǎn)可以被任何氨基酸所取代而不影響酶活性。用該酶切割后，用DNA 聚合酶將單鏈末端補(bǔ)齊為雙鏈的平末端，然后重新連接成環(huán)，轉(zhuǎn)化Lac Tet 受體菌，篩選Tetr轉(zhuǎn)化子，問：Lac 的基因型是什么？并說明原因。提示：基因型是lac—，原因是在該密碼子中插入了兩個(gè)堿基，造成了移碼突變，所以Lac 的基因是缺陷的。10．在基因工程中，為了在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)真核生物的基因產(chǎn)物，為什么通常要用cDNA而不用基因組DNA? 為什么要在cDNA前加上細(xì)菌的啟動(dòng)子？答：這是因?yàn)榧?xì)菌沒有內(nèi)含子剪接系統(tǒng)，并且不能識(shí)別真核生物的啟動(dòng)子的原因。11．如何根據(jù)下面的應(yīng)用設(shè)計(jì)探針？(1) 假定你分離純化了一未知功能的蛋白質(zhì)，需要確定是何種組織和細(xì)胞表達(dá)這種蛋白質(zhì)。(2) 假定你獲得了綿羊的胰島素mRNA，如何進(jìn)一步從人的cDNA文庫中獲得含人胰島素的克隆并使之在E. coli 中表達(dá)?提示：(1) 首先對(duì)該蛋白質(zhì)進(jìn)行部分測(cè)序，然后根據(jù)測(cè)得的氨基酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。(2) 以該mRNA 為模板反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，即可進(jìn)行標(biāo)記用作探針。 13．單鏈RNA 作為探針，具有哪些單鏈DNA 探針?biāo)鶝]有的優(yōu)點(diǎn)？答：?jiǎn)捂淩NA 探針的下列優(yōu)點(diǎn)是單鏈DNA 探針?biāo)鶝]有的：(1) RNA／RNA 和RNA／DNA 比DNA／DNA 雜交體具有更高的穩(wěn)定性。因此，雜交可以在更嚴(yán)格的各件下講行．雜交后的信號(hào)也比較強(qiáng)。(2) 單鏈RNA 由于不存在互補(bǔ)雙鏈的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，所以雜交效率比較高。(3) RNA 中不存在重復(fù)序列，所以特異性比較高。(4) 雜交后可用RNase消化掉未雜交的RNA，因此降低了本底。四、簡(jiǎn)答題（每題 6 分,共 24 分）1. 酵母作為真核基因的高效表達(dá)系統(tǒng)有什么優(yōu)缺點(diǎn)？克服大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的不足，能繁殖快，高密度發(fā)酵，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯后的修飾合加工。缺點(diǎn)：缺乏強(qiáng)有力的啟動(dòng)子，分泌效率差，表達(dá)菌株不夠穩(wěn)定，表達(dá)質(zhì)粒易于丟失等例如甲醇酵母系統(tǒng)，利用甲醇作為唯一碳源。乙醇氧化酶將甲醇氧化為甲醛，乙醇氧化酶的啟動(dòng)子是強(qiáng)啟動(dòng)子，編碼乙醇氧化酶的基因是 AOX1 合 基因的表達(dá)受甲醇嚴(yán)格調(diào)控，誘導(dǎo)表達(dá)水平可達(dá) 30％以上。五、問答題（每題 8 分，共 16 分）。2. 基因組文庫構(gòu)建的基本步驟是什么？構(gòu)建基因組文庫需要用到哪些載體？步驟①載體的制備；②高純度大分子量基因組 DNA （High molecular weight DNA, HMW DNA）的提?。虎?HMW DNA 的部分酶切與脈沖電泳分級(jí)分離（PFGE size selection）；④載體與外源片段的連接與轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞；⑤重組克隆的挑取和保存。載體的選擇：λ噬菌體，YAC,BAC,粘粒等。 基因文庫構(gòu)建的一般步驟：（1）染色體DNA大片段的制備①酶切法②物理切割法（2）載體與基因組DNA大片段的連接①粘性末端直接連接②人工接頭法（3）轉(zhuǎn)導(dǎo)受體（4）篩選重組子cDNA：以mRNA為模板合成的互補(bǔ)脫氧核糖核苷酸序列。cDNA文庫：某種生物基因組轉(zhuǎn)錄的的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種cDNA分別與克隆載體重組，貯存在一個(gè)受體菌的群體中，這個(gè)群體就稱為cDNA文庫。cDNA文庫與基因組文庫的區(qū)別在于cDNA文庫是有時(shí)效性的。cDNA文庫的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：分離的目的基因可直接用于表達(dá)；比DNA文庫小的多，容易構(gòu)建缺點(diǎn)：只與編碼序列有關(guān)；不能反映內(nèi)含子；不能反映啟動(dòng)子、終止子以及與核糖體識(shí)別的序列構(gòu)建cDNA文庫的一般步驟：（1）總RNA（total RNA）提取（2）mRNA的分離純化①原理：利用mRNA都含有一段polyA尾巴，將mRNA從總RNA（rRNA、tRNA等）中分離純化。② mRNA的分離純化 Column（柱）（3）cDNA的合成①cDNA第一鏈合成②降解mRNA模板③cDNA第二鏈合成（cDNA第二鏈合成的方法有四種，自身引導(dǎo)合成法，置換合成法，引導(dǎo)合成法和引物－銜接頭合成法。）（4）cDNA與載體連接：（5）噬菌體顆粒的包裝及轉(zhuǎn)染或質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化（導(dǎo)入宿主中繁殖）基因的化學(xué)合成：寡核苷酸單鏈的化學(xué)合成；探針的化學(xué)合成；連接子和接頭的合成；基因的半合成；全長(zhǎng)基因化學(xué)合成目的基因的分離：目的序列已知：一般采用PCR技術(shù)或分子雜交技術(shù)分離克隆目的基因目的序列未知：差異表達(dá)序列；無差異表達(dá)的目的序列，可采用文庫篩選法、功能蛋白分離法、序列克隆法 第七章高等動(dòng)物基因工程基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)的方法物理方法：裸DNA直接注射、電穿孔、顯微注射化學(xué)方法：磷酸鈣共沉淀、DEAE葡聚糖法、陽離子脂質(zhì)體法、陽離子質(zhì)粒復(fù)合物法生物學(xué)方法——?jiǎng)游锊《据d體：腺病毒、 SV腺相關(guān)病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、人牛痘病毒、皰疹病毒等。 反轉(zhuǎn)錄病毒（單鏈RNA病毒）優(yōu)點(diǎn)：A、宿主范圍廣（幾乎所有類型哺乳動(dòng)物細(xì)胞）B、效率高，可以感染大量的細(xì)胞，通常一次可以感染106～107細(xì)胞C、外源DNA在整合時(shí)不發(fā)生重排，單位點(diǎn)、低拷貝整合（一般不超過5個(gè)）缺點(diǎn)：A、只感染分裂細(xì)胞B、攜帶外源基因的長(zhǎng)度有限(8kb)C、載體病毒基因有潛在的致病性，如存在載體與人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（HERV）序列間發(fā)生D、重組而產(chǎn)生有感染能力的人逆轉(zhuǎn)錄病毒的潛在危險(xiǎn)
環(huán)評(píng)公示相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1