引物設(shè)計(jì)(丁香園)-資料下載頁(yè)
2025-06-30 00:34本頁(yè)面
【正文】 P取代dGTP對(duì)擴(kuò)增的成功是有幫助的?！ ?。 引物設(shè)計(jì)完成以后，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行BLAST檢測(cè)。如果與其它基因不具有互補(bǔ)性，就可以進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)了。 值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計(jì)難度不一。有的模板本身?xiàng)l件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物；用作克隆目的的PCR，因?yàn)楫a(chǎn)物序列相對(duì)固定，引物設(shè)計(jì)的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿(mǎn)足條件。 做RealTime時(shí),用于SYBRGreenI法時(shí)的一對(duì)引物與一般PCR的引物,在引物設(shè)計(jì)上所要求的參數(shù)是不同的。引物設(shè)計(jì)的要求： 1)避免重復(fù)堿基，尤其是G. 2)Tm=5860度?！ ?）GC=3080%. 4)339。端最后5個(gè)堿基內(nèi)不能有多于2個(gè)的G或C. 5)正向引物與探針離得越近越好，但不能重疊。 6)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度：引物的產(chǎn)物大小不要太大，一般在80250bp之間都可；80～150bp最為合適（可以延長(zhǎng)至300bp）?！ ?)引物的退火溫度要高，一般要在60度以上； 要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴(kuò)增的存在?！ 《乙镌O(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)該考慮到引物要有不受基因組DNA污染影響的能力，即引物應(yīng)該跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區(qū)，這樣可以更有效的不受基因組DNA污染的影響?！ ≈劣谠O(shè)計(jì)軟件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMEREXPRESS都應(yīng)該可以的?！ ∽鋈玖戏ㄗ铌P(guān)鍵的就是尋找到合適的引物和做污染的預(yù)防工作。對(duì)于引物，你要有從一大堆引物中挑出一兩個(gè)能用的引物的思想準(zhǔn)備尋找合適的引物非常不容易?！ ￡P(guān)于BLAST的作用應(yīng)該是通過(guò)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)你所設(shè)計(jì)的這個(gè)引物，在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并在GENEBANK中公開(kāi)的不物種基因序列當(dāng)中，除了和你的目標(biāo)基因之外，還有沒(méi)有和其他物種或其他序列當(dāng)中存在相同的序列，如和你的目標(biāo)序列之外的序列相同的序列，則可能擴(kuò)出其他序列的產(chǎn)物，那么這個(gè)引物的特異性就很差，從而不能用。
外語(yǔ)相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1