引物設(shè)計(丁香園)-資料下載頁
2025-06-30 00:34本頁面
【正文】 P取代dGTP對擴(kuò)增的成功是有幫助的。 ?！ ∫镌O(shè)計完成以后，應(yīng)對其進(jìn)行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補(bǔ)性，就可以進(jìn)行下一步的實驗了。 值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物；用作克隆目的的PCR，因為產(chǎn)物序列相對固定，引物設(shè)計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件?！ ∽鯮ealTime時,用于SYBRGreenI法時的一對引物與一般PCR的引物,在引物設(shè)計上所要求的參數(shù)是不同的。引物設(shè)計的要求： 1)避免重復(fù)堿基，尤其是G. 2)Tm=5860度?！ ?）GC=3080%. 4)339。端最后5個堿基內(nèi)不能有多于2個的G或C. 5)正向引物與探針離得越近越好，但不能重疊。 6)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度：引物的產(chǎn)物大小不要太大，一般在80250bp之間都可；80～150bp最為合適（可以延長至300bp）?！ ?)引物的退火溫度要高，一般要在60度以上； 要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴(kuò)增的存在?！ 《乙镌O(shè)計時應(yīng)該考慮到引物要有不受基因組DNA污染影響的能力，即引物應(yīng)該跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區(qū)，這樣可以更有效的不受基因組DNA污染的影響?！ ≈劣谠O(shè)計軟件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMEREXPRESS都應(yīng)該可以的?！ ∽鋈玖戏ㄗ铌P(guān)鍵的就是尋找到合適的引物和做污染的預(yù)防工作。對于引物，你要有從一大堆引物中挑出一兩個能用的引物的思想準(zhǔn)備尋找合適的引物非常不容易。 關(guān)于BLAST的作用應(yīng)該是通過比對，發(fā)現(xiàn)你所設(shè)計的這個引物，在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并在GENEBANK中公開的不物種基因序列當(dāng)中，除了和你的目標(biāo)基因之外，還有沒有和其他物種或其他序列當(dāng)中存在相同的序列，如和你的目標(biāo)序列之外的序列相同的序列，則可能擴(kuò)出其他序列的產(chǎn)物，那么這個引物的特異性就很差，從而不能用。
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