【正文】 allis非參數(shù)AN0VA 或MannWhituey U檢驗(10) 質量控制圖：毒理學試驗中各種實驗室檢驗可參照臨床實驗室制作質控圖(controlchart)，旨在直接觀測誤差趨勢，便于及早采取措施，預防和杜絕不合格的實驗報告。質控圖的種類較多，最常用的是LevyJennings常規(guī)質控圖。如果再輔以累加(Cusum)質控圖更易發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)誤差。二、統(tǒng)計學意義和生物學意義 在評價毒理學試驗結果時，要綜合評價實驗結果的統(tǒng)計學意義和生物學意義。 一般來說，具有統(tǒng)計學意義是具有生物學意義的必要條件之一。正確地利用統(tǒng)計學假設檢驗的結果有助于確定實驗結果的生物學關聯(lián)。在判斷生物學意義(即生物學重要性)時，可考慮以下步驟。 (1) 縱向比較：此參數(shù)的改變有無劑量反應關系?；瘜W物毒作用的劑量反應關系是毒理學研究的基本假設。當某參數(shù)的改變存在陽性劑量反應關系，就可認為此參數(shù)的改變與受試物染毒有關，具有生物學意義。 (2) 橫向比較：此參數(shù)的改變是否伴有其他相關參數(shù)的改變。例如，生化參數(shù)很少是彼此獨立的，單個劑量組的一個參數(shù)有統(tǒng)計學顯著性的改變一般不認為有生物學意義，除非此改變?yōu)槠渌麉?shù)改變所支持。如沒有骨髓或脾組織學改變或沒有高鐵血紅蛋白生成，則單有紅細胞計數(shù)的改變是沒有生物學意義的。同樣，在免疫毒理學中，單有淋巴細胞計數(shù)的改變不伴有淋巴結組織學改變也可能是沒有生物學意義的。 (3) 與歷史性對照比較：由于目前尚無公認的實驗動物參考“正?！敝担瑧杀緦嶒炇依孟嗤废档膶嶒瀯游锖拖嗤娜軇?，進行至少10次獨立實驗的陰性(溶劑)對照的資料構成，以其均值177。1. 96標準誤作為參考值的范圍。同時進行的陰性對照應在歷史性對照的均數(shù)177。3SD范圍之內，否則應重新試驗。另有認為，凡某種觀察值與對照組比較，差別具有統(tǒng)計學顯著性(P)，并符合下列情況之一者，即可認為已偏離正常參考值范圍，屬于有害作用。①其數(shù)值不在正常參考值范圍之內；②其數(shù)值在正常參考值范圍之內，但在停止接觸后，此種差異仍持續(xù)一段時間；③其數(shù)值在正常參考值范圍之內，但如機體處于功能或生化應激狀態(tài)下，此種差異更加明顯。應該指出，后兩種情況需要附加的試驗設計。 另外，還有一些其他的考慮。如處理組同時與對照組兩組均數(shù)之差值應超過檢測誤差的兩倍以上。某些血液生化指標(如AST、ALT等)的測定值升高才有生物學意義。當處理組數(shù)據(jù)與陰性對照組比較差別有顯著性，并且經(jīng)分析認為是與處理有關的生物學效應，應進一步判斷其為有害效應還是非有害效應。決定一種效應是否為有害作用需要專家的判斷。不同指標或參數(shù)的生物學意義和重要性是不同的。在分析和綜合評價實驗結果的統(tǒng)計學意義和生物學意義時，可能遇到四種情況，見表55。在此表中，第Ⅰ和第Ⅳ種情況最為常見，第Ⅰ種情況是無統(tǒng)計學意義也無生物學意義，第Ⅳ種情況是有統(tǒng)計學意義也有生物學意義。但是有時在實驗結果中會出現(xiàn)第Ⅱ和第Ⅲ種情況。表55 毒理學試驗結果的統(tǒng)計學意義和生物學意義生物學意義統(tǒng)計學意義無 有無有Ⅰ ⅢⅡ Ⅳ第Ⅲ種情況是有統(tǒng)計學意義但無生物學意義，例如在某個亞慢性毒性試驗中，中劑量組動物血液白細胞計數(shù)低于陰性對照組，差別有顯著性(P)，而高劑量組和低劑量組動物血白細胞計數(shù)與陰性對照組比較差別無顯著性(P)。由于在此實驗結果中未出現(xiàn)劑量反應關系，因此中劑量組血液白細胞計數(shù)降低可能是由于偶然因素造成的，沒有生物學意義。但是，如果僅在高劑量組動物血液白細胞計數(shù)降低，與陰性對照組比較差別有顯著性（P）時，必須仔細地核實高劑量組的資料。如果資料無任何疑問，可認為此變化可能具有生物學意義。最好是重新進行一個亞慢性毒性試驗，并加大受試物的劑量，如果能夠觀察到劑量反應關系，則說明此劑量組血白細胞計數(shù)降低是有生物學意義的；如果加大受試物劑量沒有觀察到劑量反應關系，才可以說此劑量組血白細胞計數(shù)降低沒有生物學意義。因此，在判斷實驗結果的生物學意義時，有無劑量反應關系是關鍵。有統(tǒng)計學意義但無生物學意義的情況，更常見的是因為實驗設計和實施不良所致。 第Ⅱ種情況是具有生物學意義但無統(tǒng)計學意義，這可能是因為該事件的發(fā)生是極端罕見的，例如在哺乳動物致癌試驗中，在染毒組中出現(xiàn)對照組中沒有的腫瘤類型，盡管從統(tǒng)計學上此種腫瘤的發(fā)生率很低，與對照組比較差別無顯著性(P)，但還應該認為是有生物學意義的。 利用一種以上的實驗動物，當某種效應在一個物種出現(xiàn)而在另一物種不出現(xiàn)，或一個物種遠比另一物種敏感時，則使結果的解釋復雜化，難以確定以哪個物種的實驗結果外推到人最為合適。除非有足夠的資料(通常是比較毒動學或毒效學資料)可以表明最合適的物種，一般是以最敏感的物種來確定NOAEL和安全限值。 以上各節(jié)我們討論了毒理學動物實驗的基礎，介紹了對外源化學物進行毒性評價的實驗設計、實施、結果分析等各個環(huán)節(jié)。實驗的質量控制是保證實驗數(shù)據(jù)具有科學性、準確性和公正性的先決條件。沒有質量保證，實驗數(shù)據(jù)的可靠性是無法肯定的。美國食品藥品管理局(FDA)于1978年就提出了“優(yōu)良實驗室規(guī)范(CLP)”，此后美國環(huán)保局(EPA)，以及經(jīng)濟發(fā)展和合作組織(OECD)都提出了類似的CLP規(guī)定。我國1988年國家科委頒布《實驗動物管理條例》，1993年國家科委頒布《藥品非臨床研究質量管理規(guī)定(試行)》，食品安全性毒理學評價程序(GBl519394)中也規(guī)定了《食品毒理實驗室操作規(guī)范》。這些法規(guī)和規(guī)范表明我國安全性毒理學評價的質量控制和質量保證也正與國際先進水平接軌。 我們在安全性毒理學試驗設計、實施、總結報告的各個環(huán)節(jié)上，應該自覺、主動地遵循GLP原則，逐步從人員的組成和職責、設施、設備、質量保證部門(QAU)、標準操作規(guī)程(SOP)、受試品與對照品、實施方案、實驗記錄和總結報告等各個方面落實GLP。第六節(jié) 食品毒理學試驗方法和安全性毒理學評價展望近十多年來，歐美在公眾動物保護潮流沖擊下和經(jīng)濟因素影響，毒理學界，提出了減少或部分取代使用實驗動物的“替代試驗方法”（alternative testing methods）?！疤娲椒ā笔鞘褂梦⑸铩⒓毎?、組織、基因動物（也包括虛擬數(shù)據(jù)庫）等來預測外來化學物對人的毒性。問題是“替代方法”如何外推到人。隨著全球經(jīng)濟一體化的趨勢，要求有一套國際認可或統(tǒng)一的毒理學試驗規(guī)范以利國際貿(mào)易進行。目前，歐洲和北美分別有政府組織在進行這方面的工作，如歐盟的“替代方法歐洲確認中心”（ECVAM）和美國的“替代方法指標確認國際協(xié)作委員會”（ICCVAM）。他們致力于國內和國際間的協(xié)調工作。這項改革涉及規(guī)范的科學性和政策性，即合理性和合法性。這是食品毒理學廿一世紀初的一件重要工作。共同認可的方法應是可靠的、成熟的、有機制依據(jù)的以及可以重復的。根本的問題是毒理實驗室出具的毒理學試驗報告在國際上被認可和接受。1995年歐盟成員國中已認可新的急性毒性分級方法，包括眼與皮膚毒性的非動物試驗方法規(guī)范，不必求出LD50。“當我們對化學物引起毒性的分子與細胞水平機理有更多了解，我們就有可能把這些知識轉變?yōu)闄C理性測試方法。當我們開發(fā)出更好的測試方法，我們就能更好地在化學物進入環(huán)境、食品或勞動場所之前和在它們損害人類健康之前預測它的毒性”（美國ICCVAM副主席Stokes語，1996）。美國EPA不久前提出：確定外源化學物、致癌物應減少依賴動物試驗，更多地采用新的分子生物學技術，更多地了解外源化學物如何損傷人的細胞和控制細胞增殖的遺傳物質，以便衡量外源化學物的致癌潛力（potential）。要得出接觸很小劑量可能產(chǎn)生的細胞損傷，而不是依靠傳統(tǒng)的大劑量的動物致癌試驗結果外推對人體的效應。這就要深入了解癌前期的分子生物學變化與毒作用機制；進行外源化學物的安全性毒理學評價很需要這樣的涉及機制的定性定量資料，當然也包括毒代動力學資料。所以，當前的發(fā)展趨勢是重視研究外源化學物更早發(fā)生的、在小劑量作用下、分子／基因方面必變的機制，從機制出發(fā)來改進現(xiàn)代毒性試驗方法(例如誘變性試驗和致癌性試驗)以及根據(jù)毒作用機制來進行安全性毒理學評價，逐步建立起國際通用的“替代試驗方法”與評價標準。多種外源化學物的聯(lián)合毒性評價對食品安全性也很重要。不僅研究同時攝入的多種外來化學物的聯(lián)合作用，而且要研究非同時攝入的聯(lián)合作用。對毒性機制研究還有另外的積極意義，即為設計新藥品和新保健食品提供有價值的資料，使之更安全和更有效。 （史永亮 王 楓）第二章 食品中化學物質的基礎毒性評價 毒理學是一門實驗科學。本章介紹最基本的毒理學試驗，包括系統(tǒng)毒性和局部毒性的研究?；A毒性是與特殊毒性相對應的，特殊毒性主要是指致癌作用、致突變作用、致畸和生殖毒性等?；A毒性研究是化學品安全性評價和危險性評價的重要組成部分。另一方面，對外源化學物系統(tǒng)毒性研究可能發(fā)現(xiàn)其毒作用的靶器官，為進一步的靶器官毒理學研究和中毒機制研究提供線索。第一節(jié) 急性毒性試驗 急性毒性試驗是毒理學研究中最基礎的工作，是我們了解外源化學物對機體產(chǎn)生的急性毒性的根本依據(jù)。1927年Trevan引入了半數(shù)致死量(LD50)的概念來評價急性毒性，此后，該指標得到廣泛應用，并成為急性毒性的主要指標?；瘜W物的急性毒性資料對于安全性評價及化學物管理方面非常重要。對急性毒性試驗程序國際上和我國已有一些法規(guī)。以下就試驗程序的基本原則和進展作一介紹。一、急性毒性和急性毒性試驗的目的 急性毒性是指實驗動物一次接觸或24小時內多次接觸某一化學物所引起的毒效應，甚至死亡。對于上述定義中的“一次”接觸在經(jīng)呼吸道與皮膚染毒時，指在一個規(guī)定的期間內使實驗動物持續(xù)接觸化學物的過程。而“多次”的概念是指當外源化學物毒性很低時，即使一次給予實驗動物最大染毒容量還觀察不到毒性作用，同時該容量還未達到規(guī)定的限制劑量時，便需要在24小時內多次染毒，從而達到規(guī)定的限制劑量。 急性毒性試驗的目的： 1. 評價化學物對機體的急性毒性的大小、毒效應的特征和劑量反應(效應)關系，并根據(jù)LD50值進行急性毒性分級。 2. 為亞慢性、慢性毒性研究及其他毒理試驗接觸劑量的設計和觀察指標的選擇提供依據(jù)。 3. 為毒作用機制研究提供線索。 通過外源化學物的急性毒性試驗，可以得到一系列的毒性參數(shù)，包括：①絕對致死劑量或濃度(LD100或LCl00)；②半數(shù)致死劑量或濃度(LD50或LC50)；③最小致死劑量或濃度(MLD，LD01或MLC，LC01)；④最大耐受劑量或濃度(MTD，LD0或MTC，LC0)，或稱為最大非致死劑量(MNLD)。以上4種參數(shù)是外源化學物急性毒性上限參數(shù)，以死亡為終點。此外，還可以得到急性毒性下限參數(shù)，即：⑤急性毒性LOAEL(觀察到有害作用的最低劑量)；⑥急性毒性NOAEL(未觀察到有害作用的劑量)。這兩個參數(shù)則是以非致死性急性毒作用為終點。因此，急性毒性試驗可以分為兩類。一類是以死亡為終點，以檢測受試物急性毒性上限指標為目的的試驗，這類試驗主要是求得受試物的LD50值。另一類急性毒性試驗檢測非致死性指標。二、經(jīng)典急性致死性毒性試驗OECD(1987)關于經(jīng)典急性毒性試驗規(guī)定如下。實驗動物首選大鼠。應設足夠的劑量組，至少3組，組間有適當?shù)膭┝块g距，產(chǎn)生一系列毒性和死亡率，以得到劑量反應關系和求得LD50。每組至少同性別5只動物，如用雌性動物，應未產(chǎn)和未孕。限量試驗劑量為2000mg/kg體重，用雌雄各5只動物進行試驗。觀察期14天，臨床觀察每天至少一次，觀察皮膚、被毛、眼睛和粘膜改變、呼吸、循環(huán)、自主和中樞神經(jīng)系統(tǒng)、四肢活動和行為方式的變化，特別要注意有無震顫、驚厥、腹瀉、嗜睡、昏迷等現(xiàn)象。準確記錄死亡時間。于染毒前、染毒后每周和死亡時測定體重。所有的動物均應進行大體尸體解剖，并記錄觀察到的全部病變，存活24小時以上的動物必要時進行組織病理學檢查?？捎萌魏我环N公認的統(tǒng)計學方法計算LD50的值及95％的可信限范圍，如B1iss法，Litchfield和Wilcoxon法，F(xiàn)inney法，Weil法，Thompson法，Miller和Tainter法等。 有關經(jīng)典急性致死性毒性試驗的要點如下： 1. 實驗動物選擇和處置 試驗要求健康成年實驗動物，一般是在小鼠、大鼠等動物中測半數(shù)致死量，并在狗中觀察毒性反應。一般嚙齒類動物年齡與體重相關，故可以用體重表示動物年齡。急性毒性試驗一般用大鼠180～240g，小鼠18～25g，家兔2～，豚鼠200～250g，狗10～15kg。不同品系的同種動物年齡相同會出現(xiàn)體重不同，以小鼠為例，純系小鼠如C57BL／BALB/C體重較小，而同年齡的昆明種小鼠則體重較大。試驗動物體重變異范圍不應超過平均體重的20％。所用實驗動物應當是雌、雄各半，雌性實驗動物要求是未經(jīng)交配和受孕的。如果發(fā)現(xiàn)受試化學物急性毒性有性別差異時，應分別求出雌性與雄性動物的LD50值。如果試驗是為致畸試驗作劑量準備，也可僅做雌性動物的LD50試驗。 實驗動物應進行檢疫，檢疫期一般為5～7天，剔除異常的動物。檢疫期與實驗期間雌、雄動物必須分籠飼養(yǎng)。實驗動物根據(jù)實驗設計的方法隨機分組。染毒途徑應模擬人可能的接觸途徑。經(jīng)口灌胃染毒，要求試驗前要對動物禁食。大鼠應過夜禁食，小鼠應禁食4小時。 大動物則在每日上午喂食前給以受試化學物。染毒后繼續(xù)禁食2～4小時。但在禁食時要保障飲水的供應。 2. 實驗設計 在進行劑量設計之前，首先要了解受試外源化學物的結構式、分子量、常溫常壓下的狀態(tài)(液態(tài)、固態(tài)或氣態(tài))、生產(chǎn)批號、純度、雜質成分與含量、溶解度、揮發(fā)度、pH值(可測時)等等。然后根據(jù)該受試物有關的測試規(guī)范要求，決定實驗設計。對于一個新的受試化學物，我們可以先查閱文獻找到與受試化學物的化學結構與理化性質相近的化學物毒性資料，取與本實驗相同動物