【正文】 超濾分離的重要因素，并認(rèn)為反滲透理論可以作為研究超濾的基礎(chǔ)。超濾法提取黃酮可以提高黃酮的純度，并降低成本，減少廢水與廢物的排放，降低了環(huán)境污染。(6)酶解法酶解法提取是在傳統(tǒng)的溶劑提取方法的基礎(chǔ)上，利用酶反應(yīng)具有高度專一性等特性，根據(jù)植物藥材細(xì)胞壁的構(gòu)成，選擇相應(yīng)的酶，將細(xì)胞壁的成分水解或降解，破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使有效成分充分的暴露出來，溶解、混懸或膠溶于溶劑中，從而達(dá)到提取細(xì)胞內(nèi)有效成分的目的的一種新型提取方法。由于植物提取過程中的屏障一細(xì)胞壁被破壞，因而酶解法提取有利于提高有效成分的提取效率。分離黃酮類化合物的主要方法有大孔樹脂法、高效液相色譜法、制備性薄層層析法和離子薄層層析法。(1)高效液相色譜法高效液相色譜是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會引起高阻力，需用高壓輸送流動相，故又稱高壓液相色譜。又因分析速度快而稱為高速液相色譜。隨著社會的發(fā)展，色譜技術(shù)的不斷更新，高效液相色譜分離技術(shù)已被廣泛的應(yīng)用，它不僅可以分離黃酮類化合物，只要樣品能制成溶液, 高效液相色譜都可以發(fā)揮它的特性，高效液相色譜只要求不受樣品揮發(fā)性的限制，流動相可選擇的范圍寬，固定相的種類繁多，因而可以分離熱不穩(wěn)定和非揮發(fā)性的、離解的和非離解的以及各種分子量范圍的物質(zhì)。高效液相色譜成為解決生化分析問題最有前途的方法。由于HPLC具有高分辨率、高靈敏度、速度快、色譜柱可反復(fù)利用, 流出組分易收集等優(yōu)點,因而被廣泛應(yīng)用到生物化學(xué)、食品分析、醫(yī)藥研究、環(huán)境分析、無機分析等各種領(lǐng)域。高效液相色譜儀與結(jié)構(gòu)儀器的聯(lián)用是一個重要的發(fā)展方向。特別是近年應(yīng)用較多的丙醇一環(huán)醚一水體系，使一些用傳統(tǒng)的甲醇(乙睛)一水體系難以分離的黃酮類化合物得到了很好的分離(姜廷福等，2002)。(2)大孔吸附樹脂法大孔吸附樹脂法是近代發(fā)展起來的一類有機高聚物吸附劑，不同類型大孔吸附樹脂均能從極稀水溶液中富集微量親水性酚類衍生物，且易洗脫，吸附作用隨吸附物質(zhì)的結(jié)構(gòu)不同而有所不同。大孔吸附樹脂具有很好的吸附性能，它理化性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于酸堿及有機溶劑，對有機物選擇性較好，不受無機鹽類及強離子低分子化合物存在的影響，可以通過物理吸附從水溶液中有選擇地吸附有機物質(zhì)，大孔樹脂是吸附性和篩選性原理相結(jié)合的分離材料，基于此原理，有機化合物根據(jù)吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附樹脂上經(jīng)一定的溶劑洗脫而分開(劉中秋，2001；史作清等，2000)。大孔吸附樹脂具有吸附快，吸附容量大，洗脫率高，樹脂再生簡單等優(yōu)點(袁易全，1996)。 (3)葡聚糖凝膠柱層析法葡聚糖凝膠柱層析法主要用兩種型號的凝膠，即SephadexG型及SephadexL H20型，試驗中常用SephadexL H20型，主要是因為SephadexL H20型的洗出液不含有雜質(zhì)(Arthur ，1977； Oomah，1996)。SephadexL H20其主要用于分離黃酮類化合物。在分離有利黃酮時，其分離方式為吸附分離；在分離大分子干類化合物時，其分離機理為尺寸排阻法分離又叫分子篩，也就是說分子量越大的被洗脫得越快，越先流出。 (4)聚酰胺法：聚酰胺法是一類纖維樹脂，分子鏈上的重復(fù)結(jié)構(gòu)單元是酰胺基的聚合物。其原理是根據(jù)“氫鍵吸附”，即當(dāng)所分離化合物的結(jié)構(gòu)與聚酰胺形成氫鍵的能力越強時，其吸附也就越強，也就越難洗脫。其用途比較廣，基本上各種類型化合物都能使用。聚酰胺薄層層析是把支持物均勻涂布于支持板(常用玻璃板，也可用滌綸布等)上形成薄層，然后用相應(yīng)的溶劑進(jìn)行展開。薄層層析可根據(jù)作為固定相的支持物不同，分為薄層吸附層析(吸附劑)、薄層分配層析(纖維素)、薄層離子交換層析(離子交換劑)、薄層凝膠層析(分子篩凝膠)等。一般實驗中應(yīng)用較多的是以吸附劑為固定相的薄層吸附層析。暨南大學(xué)理工學(xué)院食品科學(xué)與工程系柳乃奎等，利用聚酰胺層析的方法分離姜酚類物質(zhì)，試驗嘗試硅膠干柱和聚酰胺柱層析對粗姜酚進(jìn)行分離，結(jié)果表明：聚酰胺層析方法分離姜酚類物質(zhì)快速、準(zhǔn)確，且經(jīng)濟 (柳乃奎等，2005) 。(5)鉛鹽法此法過去曾用于研究，目前已很少采用。一般是在乙醇或甲醇溶液中依次加入適量中性醋酸鉛、堿式醋酸鉛水液，分別使具有鄰二酚羥基成分（包括黃酮）及含羥基成分，具有一般酚羥基的成分分離，再分別將鉛鹽沉淀懸浮于醇中，脫鉛后得到成分。高效液相色譜在黃酮類化合物的分析中得到了廣泛的應(yīng)用。色譜峰形的均一與否，主要與色譜柱的選擇和流動相有關(guān)。黃酮類化合物的分析通常用C18柱(，2006)，以甲醇、去離子水、乙腈和冰乙酸為流動相，測定沙棘葉中黃酮的總量及蘆丁、異鼠李素、槲皮素的含量。孫斌等用高效液相色譜測定沙棘籽渣中黃酮苷元含量，結(jié)果表明：每100g沙棘籽渣中蘆丁、槲皮素、山奈酚、異鼠李素的含量均有提高，且用該方法測定沙棘籽渣的黃酮苷元含量具有簡單、準(zhǔn)確、快速的優(yōu)點(姜廷福等，2002)。－可見分光光度計法紫外－可見分光光度法簡便、快速，且重現(xiàn)性好(宋寅生等，1998)。首先是試樣品溶液的選擇，黃酮類化合物易溶于甲醇等有機溶劑，采用甲醇作為紫外－可見分光光度法的溶劑。然后是標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作，一般是以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，甲醇溶解，定容，加入氯化鋁、無水乙醇等診斷劑，于420nm處測定吸光度，做蘆丁濃度對其吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。試驗樣品，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線同樣的條件進(jìn)行檢測，計算蘆丁的含量。氣相色譜法分析黃酮類化合物，主要是因為黃酮類化合物具有比較高的沸點，氣化非常困難，因此，要將黃酮類化合物衍生成黃酮衍生物，再經(jīng)氣相色譜分離測定。但是該方法操作繁瑣，應(yīng)用不普遍，且裝置較貴。沙棘果渣總黃酮的提取、精制和抗氧化性能的研究。沙棘是一種神奇的多功能植物：既能夠生產(chǎn)營養(yǎng)豐富的果實、枝葉和發(fā)熱量很高的薪柴，又具有極強的保持水土，改善生態(tài)環(huán)境的功能。因此，我國從1985年開始對沙棘資源進(jìn)行了大規(guī)模的開發(fā)利用。 自1985年在全國水土保持領(lǐng)導(dǎo)小組下設(shè)全國沙棘協(xié)調(diào)辦公室以來，各地的沙棘開發(fā)事業(yè)得以健康發(fā)展。有關(guān)省區(qū)也設(shè)立了相應(yīng)機構(gòu)，并聯(lián)合計委、科委、財政、銀行、輕工、衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)、水 利、林業(yè)、農(nóng)業(yè)、商業(yè)等部門和多學(xué)科的專家，系統(tǒng)地開展沙棘綜合利用，取得了很大成績。全國現(xiàn)有沙棘林面積2000萬畝左右，每年新增人工沙棘林面積100多萬畝，既促進(jìn)了水土保持和生態(tài)環(huán)境的改善，又為沙棘產(chǎn)品加工提供了充足原料。在黃河中游水土流失最嚴(yán)重的地區(qū)，每年種植沙棘50~80萬畝，為實現(xiàn)黃河中游黃土高原和西北地區(qū)的山川秀美作出了貢獻(xiàn)。前蘇聯(lián)的生物學(xué)家、化學(xué)家對沙棘的生物學(xué)成份，生物化學(xué)成份，生物醫(yī)學(xué)價值進(jìn)行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)其活性成份多達(dá)近 200 種，在地球現(xiàn)有的植物資源中實屬罕見，被稱為神奇之果、并在醫(yī)藥應(yīng)用方面開創(chuàng)了先河，前蘇聯(lián)衛(wèi)生部先后批準(zhǔn)了十多個醫(yī)藥批準(zhǔn)文號，并進(jìn)行了大量的臨床醫(yī)學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)沙棘確實具有十分珍貴的醫(yī)藥價值，特別在治療燒傷、創(chuàng)傷、凍傷、皮膚潰瘍等方面，具有物殊的療效。沙棘黃酮能改善心肌微循環(huán)，降低心肌耗氧量，抗血管硬化，抗炎等功能；還具有抗腫瘤、抗過敏反應(yīng)、抗衰老和抗氧化等作用。沙棘油及其果汁有抗疲勞、降血脂、抗輻射、抗?jié)?、保肝及增強免疫功能等作用。因此，探討和提取新的黃酮類化合物，日益受到人們的重視。沙棘中黃酮的要用價值得到了普遍的認(rèn)可，而且沙棘黃酮在醫(yī)藥方面有很大的發(fā)展前景，但是在我國，目前沙棘黃酮類的藥物還很少，因此，研究沙棘中有益成分的提取及分離有重要的現(xiàn)實意義。本實驗是對沙棘葉中黃酮類化合物提取、分離純化的工序進(jìn)行研究，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面的分析方法得到最佳工藝條件，以期得到黃酮得率較高和純化效果較好方法的參數(shù)。(1)利用高效液相色譜的分析方法，測定沙棘葉中黃酮類化合物的含量。將以蘆丁、槲皮素和異鼠李素為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確立測定條件，將標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜與樣品的HPLC圖譜進(jìn)行對比，計算出樣品中黃酮類化合物的含量。(2)為了從沙棘葉中獲得較多的黃酮類化合物，采用超聲波水解法和酶解法兩種提取方法，選擇得率高、成本低的方法作為本試驗的最終使用方法，并對提取溶劑的選擇、提取溫度、提取時間和料液比等對提取效果有影響的因素進(jìn)行了全面的考察。(3)通過測定F8大孔吸附樹脂和聚酰胺分離純化沙棘葉中黃酮類化合物的吸附率和解吸率，確定沙棘葉中黃酮類化合物分離純化的最佳工藝條件。71材料與方法2 材料與方法 試驗材料 材料與試劑沙棘葉 黑龍江省孫吳縣長樂山大果沙棘開發(fā)有限公司基地蘆丁 中國藥品生物制品檢定所槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品 中國藥品生物制品檢定所異鼠李素天津一方科技有限公司無水乙醇 天津市天力化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)分析純濃鹽酸 天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠生產(chǎn)分析純石油醚天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠生產(chǎn)分析純液譜甲醇 美國Fisher公司生產(chǎn)色譜純冰乙酸 天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠生產(chǎn)色譜級乙腈天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠生產(chǎn)色譜級蒸餾水自制纖維素酶湖北立業(yè)生物制品有限公司 F8大孔樹脂天津波鴻樹脂科技有限公司聚酰胺天津市津?qū)幦突瘜W(xué)有限公司 主要儀器設(shè)備KQ100DV型數(shù)控超聲波儀 昆山市超聲波儀器有限公司AL104精密電子天平上海梅特勒托利多儀器設(shè)備有限公司JD5002電子天平沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司索氏提取器浙江賽因科學(xué)儀器有限公司N1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司DHG9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司Agilent1100高效液相色譜儀美國安捷倫公司生產(chǎn)Waters高效液相色譜儀美國沃特斯公司生產(chǎn)C18色譜柱大連依利特公司生產(chǎn)飛利浦搗碎機海南伯杰科技有限公司抽濾機東莞宣宜精密機器有限公司HH4型數(shù)顯恒溫水浴鍋常州國華電器有限公司781型磁力攪拌器江蘇金壇市中大儀器廠注射器上海治宇醫(yī)療器械有限公司有機系濾膜()天津博納艾杰爾科技有限公司 試驗方法沙棘黃酮類化合物的提取一般采用有機溶劑直接萃取的常規(guī)方法，但是常規(guī)方法存在周期長、耗能高、效率低等缺點。本試驗重點研究了超聲波水解法和酶解法提取沙棘葉中黃酮類化合物，并對兩種方法進(jìn)行了比較，優(yōu)化了沙棘黃酮類化合物的提取工藝。沙棘葉去雜后用搗碎機搗碎成粉末，過40目篩子，置于溫度為60℃的真空干燥箱中干燥，當(dāng)干燥完全后以1：8的料液比加入石油醚，浸泡1 h后，于水浴鍋75℃加熱回流2 h，過濾，保留濾渣，將濾渣再以1：6的料液比加入石油醚加熱回流1 h，過濾，回收濾渣，使石油醚充分揮發(fā)至干，待提取用。超聲波水解工藝圖 沙棘葉 沙棘葉粉末 粉末與酸提取溶劑的混合液 超聲波水解 提取液 抽濾 濾液 減壓濃縮 待測液 濾渣 酶水解工藝圖沙棘葉 沙棘葉粉末 加蒸餾水混勻 加入酶液 攪拌 酶解液 加入乙醇 濾液 減壓濃縮 待測液 超聲波提取 提取液 抽濾 濾渣已有文獻(xiàn)利用分光光度計測定黃酮類化合物的較多，方便且操作簡單，但是，從沙棘葉中提取的黃酮類化合物顏色很深，如果利用分光光度計來測定，將會對分析結(jié)果干擾很大，導(dǎo)致有偏差，而且，分光光度計只能測定出總黃酮的含量，而不能測出各種成分的含量，所以，本試驗采用高效液相色譜來測定沙棘葉中黃酮類化合物的含量，此方法不僅能測定沙棘葉中黃酮類化合物的各種主要成分含量，且是一種穩(wěn)定、準(zhǔn)確的測定方法。提取液搖勻，用有機濾膜過濾到小瓶中，橡皮塞塞緊，防止揮發(fā)，待測。用注射器，每次取5μL待測樣品，進(jìn)樣，測定提取液中黃酮類化合物各組分含量。(1)檢測波長的確定文獻(xiàn)報道沙棘葉中黃酮類化合物蘆丁的最適波長為257 nm，槲皮素和異鼠李素的最適波長為368 nm，結(jié)合前人的研究成果，我們把檢測波長初步定為368 nm。實驗中我們以不同檢測波長300 nm、368 nm分別進(jìn)行三種標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC測試，結(jié)果證明368 nm波長適合三種物質(zhì)的HPLC的分析測驗。(2)色譜條件的確定大連依利特C18( mm250 mm)色譜柱，流動相為甲醇乙腈水(40：15：45)，%的冰乙酸，柱溫為30℃，流速為1 mL/min，檢測波長368 nm，定量方法為外標(biāo)法。 mg/mL的對照品溶液，置100 mL容量瓶中。按不同體積進(jìn)樣，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰高為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算回歸方程。蘆丁Y=，r2=；槲皮素Y=， r2=；異鼠李素Y=， r2=。線性范圍：~。圖21 蘆丁、槲皮素和異鼠李素的HPLC圖譜 HPLC atlas of rutin、quercet[in and isorhamnetin圖2